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PicoGreen荧光定量法测定dsDNA

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2017年1月25日

使用安捷伦BioT2022世界杯附加赛决赛ek Synergy Neo2多模式阅读器定量溶液中的DNA

作者: Paul Held，博士，安捷伦科技公司

摘要

细胞和分子生物学的一个基本要素是能够以一种能够测定少量样品的灵敏度定量大量样品中的DNA。本应用笔记描述了一种使用安捷伦BioTek量化dsDNA的方法2022世界杯附加赛决赛协同Neo2多模的读者。

简介

细胞和分子生物学的许多技术都要求能够以只需要总样品的一小部分的敏感性来量化大量样品中的dsDNA。从细菌培养物中分离质粒，从哺乳动物细胞中提取基因组DNA，用于文库生产的cDNA合成，以及用于诊断目的的PCR产物定量，都需要直接定量dsDNA。乐鱼平台入口此外，许多涉及细胞培养生长动力学或细胞周期研究的生化研究需要DNA含量归一化。

测定核酸浓度最常用的方法是测定260 nm处的吸光度(A260)，正如马蒂提斯所描述的等．1这种方法虽然适用于许多情况，但可能受到污染分子的干扰吸收。其中包括核苷酸、RNA、EDTA和苯酚在内的许多污染物通常存在于核酸制剂中。因此，已经开发了几种荧光染色技术来缓解与260 nm吸光度相关的许多问题。2 - 4PicoGreen就是这样一种染色剂，它与Agilent BioTek Synergy Neo2多模式阅读器结合使用，提2022世界杯附加赛决赛供了高特异性和高灵敏度的dsDNA定量。

材料与方法

定量it PicoGreen试剂(零件号P11495)、鲑鱼精子DNA(零件号15632011)和TE (100x)缓冲浓缩液(零件号BP-1338-1)均购自赛默飞飞科技公司。96孔黑色微孔板(零件号3915)来自康宁。用TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.5)稀释鲱鱼精子DNA至2µg/mL。最终浓度用260 nm吸光度确定。使用TE和100 μ L等分液移液到微孔板中，进行一系列从0.0到2000 ng/mL的纯化鲱鱼精子稀释。将等量(100 μ L) PicoGreen定量试剂混合，在室温下避光孵育10分钟。PicoGreen工作试剂通过PicoGreen试剂盒中提供的DMSO - PicoGreen浓缩原液稀释，按照试剂盒说明以1:200与TE稀释制备。2孵育后，使用Agilent BioTek Synergy Neo2多模式阅读器测定荧光。2022世界杯附加赛决赛通过基于滤波器的测量，阅读器使用了485 nm, 20 nm带宽的激发滤波器和528 nm, 25 nm带宽的发射滤波器以及510 nm截止二向色镜。采用单色仪检测，激发波长为485 nm，发射波长为528 nm，读取器默认带宽。读取器被设定为自动缩放灵敏度设置到最高DNA浓度。在平板移动后，使用0毫秒的秒延迟从顶部收集数据，每孔读取25次。发射光谱扫描是通过将激发固定在485 nm (9 nm带宽)，并以1 nm为增量改变发射波长进行的。激发扫描是通过将发射波长固定在528 nm并以1 nm为增量改变激发波长来产生的。所有带宽设置为9 nm, PMT增益设置为125，使用正常的读取速度。反应通常在一小时内确定。

结果与讨论

PicoGreen试剂染色的dsDNA(1µg/mL)的荧光光谱扫描显示，空白减法后，激发峰和发射峰分别在485 nm和528 nm(图1)。然后将这些波长用于后续测量，以最大限度地提高DNA滴定实验的荧光信号。

dsDNA的荧光激发和发射光谱

图1所示。PicoGreen试剂染色dsDNA的荧光激发和发射光谱(1µg/mL)。对数据进行标准化处理，使最大值为10,000 RFUs。

荧光强度测定的DNA浓度范围为0至1,000 ng/mL。在这个范围内，强度以线性方式增加。使用Agil2022世界杯附加赛决赛ent BioTek Gen5数据约简软件，可以生成最小均方线性回归分析，具有确定系数(R2)值为0.998。标准的平均方差系数(%CV)小于3%，在测试的较低DNA浓度中变化最大(数据未显示)。在敏感性方面，该方法被发现对picogram水平敏感。在适当的敏感性设置下，低至30 pg/mL的DNA浓度与仅为0 ng/mL的TE对照有统计学差异(P <0.05)。利用PicoGreen的荧光特性，结合Agilent BioTek Synergy Neo2定量dsDNA，允许研究人员定量低至6 pg/well (0.2 mL总体积为30 pg/mL2022世界杯附加赛决赛)，从而提供可靠的dsDNA浓度定量，范围超过4个数量级。

基于光谱滤波的线性检测。

图2。基于光谱滤波的线性检测。PicoGreen试剂孵育的dsDNA荧光使用485/528 Agilent BioTek Synergy Neo过滤器立方体。2022世界杯附加赛决赛dsDNA浓度范围为0.0 ~ 1µg/mL，采用最小均方线性回归分析。插入图描述了较低浓度(0至1,000 pg/mL)的数据点。数据点表示每种浓度下8种测定值的平均值。

除了用于荧光检测的过滤器立方体外，Synergy Neo2还可以配置用于激发和发射的双单色仪。与基于滤光片的检测相比，使用单色仪进行波长选择时可以观察到类似的线性(图3)。使用单色仪与基于滤光片的光学系统观察到类似的检测限(30 pg/mL)。

基于单色仪的线性检测。用PicoGreen试剂孵育dsDNA滴定时使用Synergy Neo 2单色仪进行荧光

图3。单色仪检测的线性性。使用Agilent BioTek Synergy Neo 2单色仪对PicoGreen试剂孵育的dsDNA进行荧光滴定。2022世界杯附加赛决赛激发设置为485 nm，发射设置为528 nm，激发和发射带宽均为20 nm。dsDNA浓度范围为0.0 ~ 1µg/mL，采用最小均方线性回归分析。插图描述了较低浓度(0至1,000 pg/mL)的数据点。数据点表示每种浓度下8种测定值的平均值。

尽管在原始尺度上的幅度较低，但与滤波器相比，单色器提供了更好的信号与背景比，如图4所示。这主要是由双单色仪产生的低背景测量结果。

单色器和滤光片光路的信本比比较。

图4。．单色光路和滤光片光路信号背景比的比较。绘制每个样品与空白均值(0µg/mL dsDNA)的比值。数据表示8个测定值的平均值和标准差。

结论

安捷伦B2022世界杯附加赛决赛ioTek Synergy Neo2多模式读取器是一种高度可配置的多模式微板读取器。本文研究了基于滤光片和基于单色器的荧光检测光学系统。基于过滤器的检测提供了一组具有条形码识别的预定义过滤器多维数据集。这允许阅读器确保正确的过滤器组合用于预期的荧光部分。滤光片和二向色镜的光谱特性最大限度地提高了目标上的兴奋性光以及发射信号的恢复，最大限度地提高了灵敏度。双单色系统，虽然导致较低的原始信号比滤波器系统，提供了完全的灵活性，在波长选择和带宽。此外，单色仪的高分辨率设计导致非常低的背景荧光，这转化为比基于滤波器的光学更好的信号与空白(S/B)比。

为了达到最佳的灵敏度，可以采取几种措施。去除某些常见的污染物，如蛋白质或有机物(如苯酚和丁醇)，将导致更紧密的cv和更低的背景信号，从而提高灵敏度。在PicoGreen - DNA检测中，已知有几种化合物会降低荧光信号。特别是，200 nM氯化钠或50 mM氯化镁的存在可使信号降低约1/3。在只需要测定低DNA浓度的情况下，可以使用使用较低浓度的校准曲线。此外，使用荧光塑料含量较低的微板有望减少背景，从而提高灵敏度。

参考文献

  1. Maniatis T.， E.F. Fritsch，和J. Sambrook(1982)分子克隆实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约。
  2. PicoGreen dsDNA定量试剂和试剂盒说明书，(1996)分子探针，尤金，或。
  3. Labarca, C.和K. Paigen(1980)一种简单、快速、灵敏的DNA测定方法。分析生物化学102:344-352。
  4. Ogura, M.， C. Keller, K. Koo, M. Mitsuhashi(1994)使用荧光染料YOYO-1定量固定在塑料板上的寡核苷酸。生物学技术16:1032 - 1033
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