培养细胞的差异癌症生物标志物分泌-使用ELx50自动化多路Luminex®xMAP®珠检测的清洗步骤

作者:Paul Held博士，BioTek Instruments, Inc.应用部门实验室经理，美国佛蒙特州Winooski;再次Newick,佛蒙特大学佛蒙特州伯灵顿

诊断性生物标志物是当今癌症研究的一个重要研究领域。虽然历史上对细胞间生物标记物进行了研究，但理解可溶性分泌生物标记物变得更加重要。使用来自EMD Millipore的22-plex癌症生物标志物检测板，我们在正常和低血清条件下对几种人类组织培养细胞系的癌症生物标志物的分泌进行了表征。

简介

诊断性生物标记物是癌症研究中的一个关键元素。研究主要集中在细胞内生物标志物，如HER2或BRAC1，它们可以识别特定的肿瘤，或提供可以阐明肿瘤发生过程的遗传或表型信息。最近，人们把更多的注意力放在了识别可溶性细胞外循环生物标记物上，它可以提供关于身体对癌症的反应的信息，以及肿瘤细胞与其环境之间的关系。由于癌症是一系列不同的疾病状态，对单个生物标志物的研究通常不足以研究肿瘤与其环境之间的复杂关系。例如，一个由四种已知生物标志物组成的小组，瘦素、催乳素、骨桥素和胰岛素样生长因子II，在一起使用时对卵巢癌的诊断达到了95%的预测值，但单独使用时没有预测价值[1]。虽然有些生物标记物是肿瘤特异性的，如PSA，其他的如IL-8，在许多不同来源的肿瘤中发现。

使用一组已知的肿瘤生物标记物来表征不同条件下已知谱系的肿瘤细胞系，可以更好地了解不同肿瘤类型的生物学特异性。包括肿瘤细胞在内的许多不同类型的细胞分泌的细胞信使可以通过受体介导的信号传导影响生长。如果有问题的细胞分泌一种化合物，将与自己的受体相互作用，这被称为自分泌分泌。如果分泌的信使与邻近的细胞相互作用，这种现象被称为旁分泌(图1)。内分泌分泌涉及信使信号通过毛细血管的流动和运输到远处的细胞。在培养中只有自分泌和旁分泌是可能的。

该检测基于Luminex®xMAP®技术。不同的内部颜色编码磁性微球，每个包覆特定抗体捕获和定量不同的分析物。通过使用复用珠组，几种分析物可以同时定量。

图1．自分泌和旁分泌。

材料与方法

从ATCC中获得人组织培养细胞株HepG2、HT1080和HEK293。LP9, H-Meso, GA和MI细胞由佛蒙特州癌症中心在佛蒙特大学。DMEM、F12、MEM、F12/DMEM培养基、谷氨酰胺和胎牛血清(FBS)来自Invitrogen公司。氢化可的松(Cat # H0135)和ITS (Cat # I1884)来自Sigma- Aldrich。MILLIPLEX®MAP人类循环癌症生物标志物磁珠板来自EMD Millipore。HepG2和HT1080细胞维持在添加10%胎牛血清和2 mM谷氨酰胺的MEM中。HEK 293细胞在添加10%胎牛血清的DMEM中培养。LP9、H-Meso、GA和MI细胞系维持在DMEM/F12中，DMEM/F12中添加10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺、氢化可的松100 ng/mL和ITS。在0.25%或10% FBS的存在下，从对数相生长的培养基中获得等量(1.5 mL)的条件培养基，并在Eppendorf 5415C微分离机中以14000 RPM的转速离心以去除任何颗粒。

图2。EMD微孔肿瘤生物标志物检测过程。红色文本表示由ELx50自动微缩板带清洗机。

根据试剂盒说明(图2)进行MILLIPLEX试验。首先用提供的分析冲洗缓冲液清洗一次检测板，以去除任何残留。通过对重组的人类循环癌症生物标记物组(包含22种不同的分析物)进行序列稀释(1:3)，生成8个工作多重标准。重构后，将标准品和样品各50 μL移至检测微板的珠孔中。同时，将每个单独的珠子悬浮液混合150 μL制备珠子主混合液。在每孔中加入主混合物的等分25 μL，在摇板机上搅拌，在4℃下孵育过夜。第二天，盘子被洗了3次，如上所述[2]。洗净后，加入检测或二抗试剂25 μL，室温下搅拌孵育60分钟。在加入25 μL的SAPE试剂后再次洗涤三次。经过30分钟的孵育和搅拌，以允许报告标签绑定发生，然后按照洗涤说明再次清洗板。将样品和标准品重悬于100 μL鞘液中。 Samples were then read on either a Luminex MAGPIX ® or a 100 (LX100) reader with XPONENT software using the parameters outlined in the assay kit instructions.

的ELx50在这些实验中使用的Microplate Strip Washer (BioTek Instruments)配置了96孔平面磁铁(P/N7103016)．Wash程序通过键盘配置，使用“Link”实用程序加入三个独立的例程，如前面描述的[9]。最初的60秒浸泡允许珠捕获，而阶梯式吸入方案减少珠损失从吸入。

结果

当检测人类细胞系的癌症生物标志物分泌时，观察到非常不同的表达模式。所有已建立的细胞系都分泌IL-8和MIF，这两种都是炎症的标志。HepG2细胞分泌的不同肿瘤标记物数量是被测细胞系中最多的。HepG2细胞在加入或不加入血清培养时均能分泌大量AFP。除AFP外，HepG2细胞还分泌CYFRA21-1、MIF、OPN和VEGF。有趣的是，当血清浓度为10%时，CYFRA21-1和IL-8的分泌量更大。(图3)

图3。HepG2细胞上的癌症生物标志物22-plex检测。

HT1080细胞也分泌了许多不同的分子，包括大量的IL-8。除了IL-8，这些细胞还分泌一定量的ß-HCG, FGF2, MIF, OPN, TGF-ß和VEGF。由于血清的作用，许多这些分子的信号增加，特别是IL-8、VEGF和MIF。

图4。ht1080细胞的肿瘤生物标志物22-plex检测。

当使用MILLIPLEX检测板对HEK293细胞进行鉴定时，仅发现IL-8和MIF癌症标志物大量分泌。与测试的其他细胞系不同，IL-8在没有血清而不是有10%胎牛血清的情况下显示出更高的水平。MIF在含血清或不含血清时均有高水平分泌。低水平的TNF-∞也被检测到。

图5。hek293细胞的肿瘤生物标志物22-plex测定。

LP9间皮细胞分泌IL-6、IL-8和MIF标记物，其中IL-8最为丰富。与0.25%的血清样品相比，这三种标记物均显示10%胎牛血清存在时信号增加。

图6．LP9细胞上的癌症生物标志物22-plex检测。

对三种不同的恶性间皮瘤细胞系进行了鉴定。观察到这些细胞系之间有许多共性。和其他测试的细胞系一样，间皮瘤细胞分泌IL-8和MIF。它们和间皮细胞系LP9一样，也产生IL-6，这表明间皮衍生细胞系分泌IL-6。有趣的是GA和MI细胞系也分泌CYFRA21-1，而H-Meso细胞系不分泌CYFRA21-1。与H-Meso细胞系相比，GA和MI细胞系是最近才分离出来的。与未分化的已建立系(如HEK293)一样，间皮瘤细胞系通过产生更多的某些标记物来应对低血清。H-Meso和GA细胞系在低血清时分泌更多的IL-6和IL-8，而MI产生更多的CYFRA21-1。

与10%血清相比，H-Meso和GA细胞在高血清中产生更多的MIF。低血清水平也可诱导MI细胞分泌FGF2(图7)。

图7。间皮瘤细胞系的癌症生物标志物22-plex测定。

讨论

这些细胞系在分泌的癌症标记物方面表现出明显不同的表型。一般来说，22种癌症标记物中只有少数是由被测试的细胞系分泌的。IL-8的分泌在所有细胞系中是最一致的。白介素- 8是一种由许多不同类型的细胞产生的趋化因子。它与CXCR1和CXCR2受体相互作用，这是GPCRs。虽然它的主要功能被描述为化学引诱剂和炎症介质，但它也被证明能促进细胞增殖。有趣的是，当5个细胞系在10%的血清中增加IL-8的分泌时，HEK293和GA细胞实际上减少了培养液中IL-8的分泌量。MIF也被发现在所有细胞类型中都有一定程度的分泌，在大多数细胞系中随着血清的升高而增加。产生少量MIF的MI细胞系显示出少量的减少。MIF，最初被确定为炎症的关键元素，也被证明在肿瘤进展和细胞增殖中有作用。 The connection between inflammation and cell growth has been observed to be a factor in tumor promotion.

观察到HepG2细胞分泌AFP并不令人惊讶。∞-胎蛋白糖蛋白(AFP)是胚胎期由卵黄囊和肝脏产生的一种主要血浆蛋白，被认为相当于胎儿的血清白蛋白。虽然出生时婴儿的这一标记物含量很高，但在出生后的第一年，AFP水平会下降到几乎无法检测到的水平。在成人中，只有在三种情况下才会出现水平升高:肝细胞癌、睾丸或卵巢的生殖细胞肿瘤和源于肝脏肿瘤的转移性癌症。HepG2细胞来源于一名15岁白人美国男性的肝组织，他患有分化良好的肝细胞癌。这些细胞也会分泌血浆蛋白，如白蛋白、转移蛋白、纤维蛋白原、∞2-巨球蛋白和纤溶酶原。由于这些细胞来源于分化良好的肝脏肿瘤，人们认为它们会分泌AFP。

人胚胎肾293 (HEK293)细胞是20世纪70年代初由腺病毒[5]转化正常胚胎肾细胞产生的细胞系。虽然最初认为它们在本质上是成纤维细胞或上皮细胞，但最近的证据表明，它们在本质上可能是神经元[6]。这种不确定性使它们成为正常细胞或癌细胞的不良模型，但它们易于培养和转染，这使它们成为实验中最受欢迎的细胞类型不是实验的基础。HEK293分泌IL-8的增加是一个有趣的现象。许多肿瘤标记物的增加可以解释为对胎牛血清中刺激细胞生长的生长因子的反应。IL-8分泌的显著增加可能是这些细胞在没有外源性生长刺激的情况下维持生长的自分泌和旁分泌反应。或者，也可以将数据解释为实际上是大多数细胞系分泌的下调，以响应高血清。

HT1080细胞是从纤维肉瘤[7]中分离出来的已建立的人成纤维细胞系。HT1080在裸小鼠中没有接触阻滞，被认为是激活的N-ras表型[8]的结果。人间皮LP9/TERT-1 (LP9)细胞是一种htert永生化细胞系，表型和功能类似于正常的人间皮细胞[9]。H-Meso细胞是1987年从人恶性间皮瘤中分离出来的细胞系，经历了多次细胞遗传学重排。GA和MI细胞系是由佛蒙特癌症中心从两个不同的恶性间皮瘤个体中分离出来的。从它们的起源来看，H-Meso, GA和MI细胞系的行为应该是相似的，但它们有不同的表型以及对血清的不同反应。这些差异最容易解释的是，这些细胞系经历了不同的多阶段癌变路径。

细胞系之间关于它们对血清反应的差异是有趣的。培养中的细胞可以产生和分泌刺激自身(自分泌)和邻近细胞(旁分泌)调节生长的因子。在FBS存在的情况下，人们会期望所有必要的生长因子都存在，以刺激细胞生长。在高血清条件下，癌症标志物的增加似乎是生长的结果，而不是生长的必要条件。

大量的样本使得自动机的使用变得至关重要。该ELx50自动微板带洗衣机可以配置为洗磁珠使用磁铁固定珠或聚苯乙烯珠使用真空过滤歧管。用于清洗步骤在时间和精力方面是一个巨大的帮助。ELx50在不到4分钟的时间内对整个盘子进行清洗，同时允许步行操作。除了快速和高效，洗衣机为每一步洗涤提供一致的结果。多路复用与清洗步骤的自动化相结合，可以以最小的工作量、试剂使用量和时间生成大量的样品数据。

参考文献

1. Mor, G, I. Visintin, Lai, H. Zhao, P. Schwartz, T. Rutherford, L. Yue, P. Bray-Ward, D.C. Ward(2005)血清蛋白标志物在卵巢癌早期检测中的应用:中华肿瘤学会学报，102(21):7677-7682
2. Held, P.(2011)基于MAGPIX®阅读器系统的多重珠检测的自动清洗BioTek应用注释XXX。
3. Itoh, Y. T. Joh等人(2005)IL-8通过金属蛋白酶切割proHB-EGF促进人结肠癌细胞增殖和迁移，细胞因子29(6):275-282。
4. 邢翔，陈鸿坤，杨建军，李晓霞，甘宏，刘谦，T. Coleman, Y. Al-Abed(2009)巨噬细胞迁移抑制因子促进结直肠癌。中华医学15:1-10。
5. Graham FL, Smiley J, Russell WC, Nairn R(1977)由人腺病毒DNA转化的人细胞系的特性。病毒学杂志36:59-72。
6. 邵逸夫，莫斯，阿拉拉特M，格雷厄姆(2002年6月)。“人腺病毒对人神经细胞的优先转化和hek293细胞的起源”。法理学杂志，16 (8):869-71
7. 拉希德,美国;西澳Nelson-rees;托斯。;Arnstein p;M.B.加德纳(1974)。一种新衍生的人肉瘤细胞系(HT-1080)的特性。癌症33:1027-33。
8. Paterson, H. B. Reeves, R. Brown, A. Hall, M. Furth, J. Bos, P. Jones，和C. Marshall(1987)激活的N-ras控制HT1080人纤维肉瘤细胞的转化表型，细胞，51:803-812。
9. MA Dickson, Hahn WC, Ino Y, Ronfard V, Wu JY, Weinberg RA, Louis DN, Li FP, Rheinwald JG。表达hTERT并绕过p16(INK4a)强制的限制寿命的机制的人类角质形成细胞，在保持正常生长和分化特性的情况下，成为不朽的细胞。Mol Cell Biol 2000; 20:1436-1447。
10. Reale, f.r.t griffin, J. Compton, S. Graham, P. Townes和a . Bogden(1987)人类恶性间皮瘤细胞系(H-Meso-1)的表征:一个双相实体和腹水肿瘤模型。癌症研究47:3199-3205。

缩写

细胞角化蛋白19片段(CYFRA21- 1);巨噬细胞迁移抑制因子(MIF);骨桥蛋白;血管内皮生长因子;人合唱促性腺激素(ß-HCG);成纤维细胞生长因子2;转化生长因子β (TGF-ß);胎牛血清。

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