通过使用自动、高通量AlphaScreen-Based Assay测定内源性细胞激酶活性

作者: Brad Larson和Peter Banks，应用部门，BioTek仪器公司，维诺斯基，佛蒙特州

简介

细胞激酶是许多细胞信号通路的关键组成部分。它们在将信息从位于细胞膜上的受体传递到细胞内其他位置的过程中起着重要作用。它们所涉及的过程对细胞和有机体的发育和生命周期至关重要。这些包括但不限于血管生成、细胞生长、细胞迁移和细胞凋亡。过表达，或构成性激酶活性，也与许多疾病状态有关，包括血管疾病，骨骼疾病和多种形式的癌症。正因为如此，细胞激酶，包括受体酪氨酸激酶和蛋白激酶，仍然是小分子和大分子药物开发中筛选最多的靶点之一。因此，能够对化合物或抗体进行筛选，以快速和强大的方式确定它们对这些信号分子的拮抗作用，对于目前在这一领域的努力至关重要。

在这里，我们描述了一种基于细胞的方法，使用AlphaScreen®SureFire®技术来量化信号转换器和转录激活因子3 (STAT3)的磷酸化。在细胞因子或生长因子刺激通路后，STAT3被受体相关激酶磷酸化。然后转位到细胞核，蛋白质充当转录激活剂。磷酸化激酶的检测包括加入AlphaScreen®供体和受体珠，以及针对STAT3蛋白或Tyr705磷酸化位点的特异性抗体。激活适当的信号级联会导致发出的520-620 nm之间的发光信号增加，而拮抗则会显示相反的效果。

采用粘附细胞法和非粘附细胞法自动检测。所有配药步骤均采用非接触式配药完成，并为贴壁细胞模型加入96针冲洗管汇。通过将高性能激光激发和基于滤波器的PMT检测集成到新型HTS微板阅读器中，实现了lv384阱格式的受体珠发光信号的快速量化。

AlphaScreen®SureFire®STAT3 (pTyr705)检测

夹层抗体复合物在分析物(pSTAT3)存在时形成。然后，复合物被AlphaScreen®供体和受体珠捕获，使它们靠近。供体珠在680纳米的激发激发单线态氧分子的释放，引发受体珠中的能量转移级联，导致520-620纳米的光发射。

图1．AlphaScreen®SureFire®STAT3 (pTyr705)检测。

材料与方法

材料

细胞和试剂

A431细胞(目录号85090402)购自Sigma-Aldrich公司(圣路易斯，密苏里州)。Dulbecco 's Modified Eagle Medium (DMEM)(目录号11995-065)、青霉素-链霉素、液体(目录号15140-148)和胎牛血清(FBS)(目录号10437-028)购自Life Technologies (Carlsbad, CA)。人血清白蛋白(HSA)， 25%溶液(目录号1500233)购自Baxter (Deerfield, IL)。AlphaScreen SureFire STAT3 (p-Tyr705) Assay Kit - 10,000 PointsTGRS3S10K)购自PerkinElmer (Waltham, MA)。Hank 's平衡盐溶液(HBSS)购自Mediatech, Inc. (Manassas, VA)。重组人表皮生长因子(EGF)cyt-217)购自prospect - tany科技基因有限公司(以色列内斯锡奥纳)。SD 1008(目录编号3035)、static(目录编号2798)和Cryptotanshinone(目录编号3713)购自研发系统公司(Minneapolis, MN)。384井，低容量，未处理板(目录编号3674)，384井，低容量，TC处理板(3826)和透气密封胶带(目录编号3345)由康宁生命科学(Kennebunk,ME)捐赠。

仪表

MultiFlo™微板分配器

该分配器通过其两个蠕动泵和两个注射泵提供快速，准确的平板分配能力，容量范围从0.5-3000 μL。该仪器用于分配细胞、激动剂、改良的裂解缓冲液(非粘附细胞试验)以及低至2 μL的受体和供体珠混合物。

EL406™组合洗衣机分配器

EL406通过其双动作™歧管提供快速，准确的介质清除和洗板功能。它还通过使用蠕动泵或注射泵提供试剂分配功能，容量范围为0.5-3000 μL/井。本仪器用于贴壁细胞检测，去除培养基和化合物，用Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)清洗细胞，加入2 μL体积的改性溶解缓冲液。

Synergy™NEO HTS多模式微板阅读器

该阅读器结合了一个过滤器和单色仪为基础的检测系统在一个单元。专用的高性能激光和基于滤波器的PMT检测系统用于激发供体珠和量化发射的发光信号。

自动化检测程序

图2。自动化检测工作流程。培养条件:A.血清饥饿- 18小时@ 37°C/5% CO₂；B.拮抗剂孵育- 60分钟@ 37°C/5% CO₂；激动剂孵育- 10分钟@ 37°C/5% CO₂；D.裂解孵育- 30分钟@ RT并摇晃;E. AlphaScreen®珠孵卵- 2分钟@ RT，摇晃，然后2小时@ RT。AlphaScreen®信号检测使用协同NEO具有以下设置:板块移动后延迟:0毫秒;激发时间:80 msec;激励后延时:120 msec;集成时间:160 msec;读取高度:8.0 nm;200年获得。

方法

细胞繁殖

A431细胞在完全培养基中繁殖，如上所述。在试验开始前18小时对细胞进行血清饥饿，方法是将细胞从烧瓶中胰蛋白酶化，去除全部培养基，用无血清培养基(SFM) (DMEM + 0.1% HSA)替换。

细胞板

对于贴壁细胞检测，细胞稀释至1.0 × 106个/mL，并在10 μL体积中镀。用透气密封胶带覆盖板以防止蒸发，并在37°C/5% CO下孵育₂血清饥饿期。对于非贴壁细胞试验，在血清饥饿期之后，A431细胞从烧瓶中取出，重新悬浮到2.5x10的浓度⁶细胞/mL，以4 μL体积镀于HBSS缓冲液中。

配体/复合制剂

EGF在浓度为16.07 μM的milliq水中重悬。然后在SFM(粘附细胞协议)或HBSS缓冲液(非粘附细胞协议)中使用1:3稀释滴定配体。化合物在浓度为10 mM的100% DMSO中重悬。然后在DMSO中以1:2稀释滴定。化合物进一步在SFM或HBSS缓冲液中1:25稀释，以产生最终的4X浓度。

实验测定程序

分析优化-细胞裂解

最初的实验揭示了无效的细胞裂解，这对数据质量产生了负面影响。改良的裂解缓冲液，将活化缓冲液合并到裂解缓冲液中，制造商推荐用于更难裂解的细胞。通过评估用高浓度和低浓度EGF刺激的细胞的信号比，使用三种不同的细胞浓度对两种裂解缓冲液进行了测试。采用非粘附细胞方案进行评估。

分析优化-细胞浓度

用非贴壁细胞试验测试了三种细胞浓度(5,000、10,000和15,000个细胞/孔)，以确定受刺激细胞和未受刺激细胞之间是否可以实现更大的信号比。贴壁细胞试验也使用相同的浓度进行。用于这种分析格式的协议要求在添加裂解缓冲液之前去除所有介质。有人认为，通过向细胞中添加未稀释的裂解缓冲液，可以实现更可靠的测定。

自动检测验证Z′因子

进行Z′因子实验以验证优化后的自动化分析程序。Z '因子]值考虑了阳性对照和阴性对照之间信号的差异，以及重复之间信号的变化。纳入了0-1的范围，0.5的值表示一个优秀的测定方法。因此，该测量是对使用这两种分析格式的后续实验产生的数据质量的极好估计。

受体激动剂滴定

通过使用EGF创建激动剂剂量反应曲线，进一步验证了实验结果。如前所述，在HBSS缓冲液或SFM中创建序列1:3滴定。测试的浓度范围为8000 - 0纳米。

对手的评价

使用三种已知的STAT3通路抑制剂SD 1008、static和Cryptotanshinone进行药理学验证，以1倍浓度100 μM为起始浓度，采用1:2稀释方案建立11点滴定。在抑制剂潜伏期结束后，最后加入1X EC的EGF₈₀浓度。

结果与讨论

细胞裂解缓冲优化

图3所示的结果表明，修改后的裂解缓冲液，包含激活缓冲液，提供了更完整的细胞裂解。更高浓度的磷酸化激酶能够与供体和受体珠相互作用，从包含受刺激细胞的孔中产生更高的信号。还可以看出，含有较低数量细胞(15,000个细胞/孔)的孔比含有较高细胞浓度的孔提供更大的信号比。较大数量的细胞可能会对检测结果产生负面影响。这一假设在随后的细胞浓度评估中得到了验证。

细胞浓度分析

图4．细胞浓度优化比。受8,000、5,000、200或1 nM EGF刺激的细胞的Alpha信号比率。用改良的裂解缓冲液裂解细胞。

当浓度为10,000个细胞/孔时，来自受刺激细胞和未受刺激细胞的信号比例最高。这对两种分析格式都是正确的。结果还表明，贴壁细胞检测格式可获得更高的比率。这很可能是由于将裂解缓冲液直接添加到电流体积很小或没有电流的井中。由于这一发现，两种检测格式将进行进一步测试，使用细胞浓度为10,000个细胞/孔。

图5。Z′因子验证数据。实验在激动剂模式下进行，EGF作为对照激动剂。分别用44个重复的600 nM和0 nM EGF作为阳性和阴性对照。准备细胞，并按照前面描述的方法进行分析。

Z′值分别为0.60和0.72，分别由非粘附细胞和粘附细胞测定。如上所述，这些值表明使用这两种测试格式进行了优秀、可靠的分析。

受体激动剂滴定

图6。EGF激动剂滴定结果。所示数据表示在每种EGF浓度下测试的四个重复的平均值和标准偏差。

欧共体₅₀在A431细胞中，EGF刺激STAT3信号通路的90.5和78.6 nM的值与实验制造商先前生成的180 nM的值一致。一个电子商务₈₀由EC产生约200 nM的值₅₀每条曲线的值和坡度。该浓度的EGF用于后续的拮抗剂测试。

对手的评价

图7。复合抑制曲线。绘制出每种浓度的测试抑制剂刺激EGF的百分比。所示数据为n=4次重复的平均值和标准差。

表1。STAT3抑制剂IC₅₀值。

抑制曲线和IC₅₀用非粘附细胞和粘附细胞测定方法对每种化合物进行测定。然后将每种分析格式的结果与已发表的文献值进行比较。数据集之间的紧密一致性表明，在测试其他未知的STAT3通路抑制剂时，每种分析格式都有能力产生准确的结果。

结论

AlphaScreen®SureFire®检测格式为激酶信号通路调制的评估提供了一种敏感的，功能性的基于细胞的格式。测试证明，贴壁细胞方案提供了一个更强大的分析平台，具有更大的分析窗口和更高的Z '值。使用EL406™或MultiFlo™的吸吸和非接触分配功能，每个检测过程都可以在低容量384孔格式中轻松自动化。Synergy™NEO微板阅读器的基于激光的激发和基于滤波器的检测系统也能够轻松有效地量化AlphaScreen®Acceptor珠发射的信号。液体处理和检测仪器的结合，为使用Alpha技术分析STAT3通路激活剂和抑制剂创造了理想的解决方案。

参考文献

1. 张。:用于评估和验证高通量筛选测定的简单统计参数。生物分子筛选1999 4(2):67-73。
2. 段。8-苄基-4-氧氧-8-氮杂双环[3.2.1]辛-2-烯-6,7-二羧酸(SD-1008)，一种新型Janus激酶2抑制剂，增加人类卵巢癌细胞的化疗敏感性。分子药理，2007 72(5):1137-45。
3. Schust。Stattic: STAT3激活和二聚的小分子抑制剂。化学与生物2006 13(11):1235-42。
4. 胫骨。隐丹参酮通过阻断DU145前列腺癌细胞的二聚体抑制其组成性信号换能器和转录激活因子3功能。癌症研究，2009(1):193-202。

确认

作者要感谢Mark Rothenberg和康宁生命科学公司慷慨捐赠的微孔板和透气板密封胶带。这些贡献促成了项目的成功。

AlphaScreen®和SureFire®是PerkinElmer, Inc.的注册商标。