细胞周期时间的测定

用蛋白质和DNA染色监测同步细胞的细胞期

作者:保罗·赫尔德博士安捷伦科技有限公司

摘要

细胞的生长和分裂通过基因表达、核酸复制和细胞分裂的模式进行，即细胞周期。不受控制的增殖是恶性肿瘤的标志;因此，细胞周期长度的确定是阐明细胞生长动力学参数的关键因素。本应用笔记描述了使用免疫荧光染色的PC-3细胞同步胸苷阻滞或有丝分裂标记的异步细胞作为计算细胞周期时间的手段。

简介

在增殖细胞中，细胞周期由四个阶段组成。间隙1 (G1)是有丝分裂和DNA复制之间的间隔，以细胞生长为特征。G1中限制点(R)发生的转变使细胞进入增殖周期。如果信号这种转变的条件不存在，细胞退出细胞周期并进入G0，在此期间发生生长、分化和凋亡。DNA复制发生在合成(S)阶段，随后是第二个间隙期(G2)，在此期间发生生长和细胞分裂的准备。有丝分裂和两个子细胞的产生发生在M期(图1)^[1]．这一调节过程中任何一步的功能障碍都可能导致异常的细胞增殖，这是许多病理状况的基础，最显著的是癌症和衰老。了解细胞周期进程的一个关键测量参数是完成一个完整生长周期所需的时间长度。

图1所示。细胞周期的调节。

细胞培养的细胞周期长度可以使用异步或同步细胞模型来确定。异步判定使用物理上可观察到的单元过程作为计算总的单元周期时间的方法。同步方法使用细胞物理特性或细胞周期进程的短暂中断作为在细胞周期的特定阶段分离细胞的手段。虽然异步方法不会干扰细胞，但除了处理细胞的细胞周期进展的时间长度之外，它提供的信息很少。同步方法可以在细胞周期的特定部分分离细胞，但有可能通过药物治疗或物理创伤扰乱正常的细胞过程。

有丝分裂指数，这是百分率的细胞进行有丝分裂在任何时候，是最常用的标记用于异步测定。通过知道有丝分裂的时间长度，可以使用有丝分裂的长度与整个细胞周期时间的比率作为计算倍增时间的手段。理论上，观察到有丝分裂细胞的概率是有丝分裂持续时间与整个细胞周期的比率。假设有丝分裂的持续时间相对恒定;极端的假设情况是0或1，其中分别没有有丝分裂细胞或没有间期细胞。实际上，这一比例介于这两个极端之间。因此，当有丝分裂持续时间占细胞周期的一半时，观察到有丝分裂细胞的概率为0.5。

同步方法通过细胞的物理特性或化学手段分离细胞。方法根据物理特性，如离心洗脱^［5］它根据细胞大小或有丝分裂抖动分离细胞，根据细胞附着分离细胞^[6]这种方法不会将细胞暴露在化学试剂中，但可能需要昂贵的专门仪器或非常劳动密集型。几种化学制剂已被证明可在细胞周期的特定阶段可逆地使细胞失速。HMG-co A还原酶抑制剂洛伐他汀已被证明能阻断G1期的细胞^[7]．诺科达唑同样可以阻止微管组装^[8]以及抑制CDK1活性的RO3306^[9]阻滞细胞在G2。

虽然有许多化学方法来同步培养哺乳动物细胞，其中最广泛使用的方法是胸苷阻滞。过量的胸腺嘧啶对胞苷- 5'-磷酸生成脱氧胞苷三磷酸产生负反馈。缺乏dCTP导致细胞周期在s期停滞。由于在应用抑制剂时，细胞会在整个s期被抑制，因此使用第二轮胸苷激酶，在两者之间释放，以诱导更多的细胞在s期早期被抑制。

胸苷阻滞的基础涉及核糖核酸还原酶(RNR)。正常情况下，RNR复合体将嘌呤(ADP和GDP)和嘧啶(CDP和UDP)的二磷酸核糖核苷酸还原为脱氧核苷酸形式，然后分别形成脱氧三核苷酸(dNTP)池、dATP、dGTP、dTTP和dCTP(图2)。该酶复合体以双峰方式调控。a位点与ATP锥区结合，通过打开或关闭酶来调节整体活性。ATP与该位点的结合导致酶被打开，而dATP的结合将抑制酶的活性。因此，ATP与dATP的细胞浓度之比调节整体活性。其次，高浓度的dTTP和dGTP的存在作为特定核苷酸生产的调节剂。最重要的是dTTP对嘌呤UDP和CDP分别转化为dUDP和dCDP的变构抑制。胸腺嘧啶阻断后，大量的胸腺嘧啶(dT)出现，导致酶胸腺嘧啶激酶产生dTTP，这是一个独立的打捞途径的一部分(图2)。与胸腺嘧啶不同，没有脱氧胞苷(dC)的打捞途径来产生脱氧胞苷三磷酸(dCTP);在高dTTP水平的存在下，RNR酶的变构抑制导致低水平的dCTP，导致DNA复制的停止。

在这篇论文中，我们同时使用同步和异步单元来计算PC-3单元的单元周期时间。

图2。dNTP池调控核糖核苷酸还原酶的原理图。

材料与方法

细胞培养

PC-3细胞在添加10%胎牛血清和青霉霉素的Hams F12K培养基中培养，37℃，5% CO₂．培养在80%合流时常规胰化(0.05%胰蛋白酶- edta)。为了实验，细胞被镀入康宁3904黑边透明底96孔微孔板。

胸腺苷双阻滞

PC-3细胞以每孔4000个细胞的密度、100 μL的体积接种到Corning 3904板中，在37℃、5% CO的条件下吸附过夜₂在潮湿的环境中。第二天，在所有孔中加入胸苷，最终浓度为2 mM。处理细胞16小时后，用新鲜培养基洗涤1x释放细胞，然后加入100 μL不含胸苷的培养基。细胞生长9小时后，第二次加入最终浓度为2 mM的胸苷激酶。细胞经胸腺嘧啶处理16小时，按上述方法释放。盘子立即装进了一个BioSpa™8细胞周期进展的自动化培养箱。

细胞周期进程

在最后的胸苷阻滞释放后，使用BioSpa 8系统来控制实验时间并保持必要的环境控制。用4%的PFA固定两个钢板的单独条带，每隔1小时使用a固定10分钟MultiFlo™外汇多模式分配器附加到系统。固定细胞用200 μL PBS维持至实验结束。

染色

所有用于细胞固定和荧光染色的细胞清洗和试剂添加均使用EL406™清洗机进行。用200 μL PBS (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 7.4 mM)将细胞冲洗2倍，50 μL PBS加3%山羊血清和0.3% Triton X-100使细胞通透，阻断非特异性抗体结合120分钟。阻断后，加入Rabbit ant-geminin (ab195047, Abcam)或Rabbit anti-phospho-histone H3抗体(53348S, Cell Signaling Technologies)(1:200稀释PBS, 1% BSA, 0.3% Triton X-100)， 5°C孵育过夜。用PBS清洗2倍，加入Alexa Fluor 488标记的荧光抗兔IgG抗体(P/N A11008, Life Technologies) (PBS 1:200稀释，1% BSA, 0.3% Triton X-100)，在室温下孵育120分钟，然后用PBS清洗3倍。用Hoechst 33342 (10 μM)工作液50 μL复染15min，然后用DPBS 200 μL洗涤2次。吸气后，所有孔均加入250 μL PBS，用透明胶粘板封片器封板。

成像

每口井的蒙太奇(6 × 6)图像使用2022世界杯南美区预选赛 细胞成像多模式阅读器配置有DAPI和GFP LED立方体，使用10倍物镜。DAPI立方体配置了一个377/50激励滤波器和一个447/60发射滤波器，以及一个409 nm截止二向色镜。GFP立方体配置了一个469/35激励滤波器和一个525/39发射滤波器，带有一个497 nm的二向色镜。使用Gen5软件设置成像参数，DAPI使用LED强度设置为5，集成时间为72 msec，增益为0,GFP使用LED强度设置为5，集成时间为72 msec，增益为0。

分析

表1。图像处理与图像分析蛋白质测定的参数。

图像使用Gen5™Microplate Reader和Imager软件自动拼接成单个文件。拼接后，对蒙太奇图像进行预处理，在分析前减去背景荧光(表1)。初级掩模分析分别使用阈值5000和大小上限5 μm和50 μm识别细胞核。使用将核总荧光与物体计数相关的Gen5直方图分析设置荧光信号的上限和下限阈值，识别G1和G2亚群。G1和G2之间的中间区域被用来识别s期细胞。除了基于DAPI核染色的细胞周期相亚群外，使用平均GFP荧光阈值10,000鉴定p-组蛋白H3和geminin阳性核。

结果

通过DNA含量和蛋白质表达监测同步细胞的细胞周期进程。用Hoechst 33342染色的细胞核，荧光与核酸含量有关。细胞周期G2期的细胞在有丝分裂前复制DNA，核酸是G1期细胞的两倍，而DNA合成过程中的细胞(s期)荧光介于G1和G2之间。这种循环可以在图3中观察到，其中特定G1、S和G2亚群中的细胞百分比随时间而振荡。G1细胞百分比在胸腺嘧啶释放后6和26小时达到峰值，而G2细胞在16和36小时达到峰值。s期细胞亚群在释放后11和31小时达到峰值。这些数据表明胸腺嘧啶释放后PC-3细胞的细胞周期时间约为20小时。

图3。同步PC-3细胞的细胞周期进展。双胸苷阻滞同步PC-3细胞释放后定时固定染色。通过核染色分析，绘制G1、S和G2细胞百分比随时间的变化曲线。红色和蓝色箭头分别表示G1和G2百分比峰值。数据点代表八个决定的平均值。

蛋白质表达也随细胞周期而波动。使用特异性抗体，可以监测细胞核中geminin和p-组蛋白H3蛋白的存在与否(图4)。图5显示了胸苷释放后4小时和24小时这些蛋白的蛋白水平的显著差异。对48小时内样品的图像分析显示了geminin和p-Histone H3的时间和周期关系。在细胞周期的G1和G2阶段，可以在细胞核中检测到高百分比的双联蛋白，而在有丝分裂期间几乎不存在。磷酸组蛋白H3几乎只在有丝分裂期间被检测到(图5)。

图4。同步PC-3细胞的Geminin和p-组蛋白染色。同步PC-3细胞在胸苷激酶释放后4和24小时固定。在平行反应孔中分别用兔抗geminin和兔抗p组蛋白H3一抗处理细胞。用Alexa Fluor 488标记的山羊-兔IgG二抗染色观察特异性靶点。用Hoechst 33342反染色鉴定细胞核。图像使用20x物镜和2 x 2缝合蒙太奇捕捉。

与DNA含量一样，蛋白表达峰值表明同步PC-3细胞的细胞周期时间为20小时。胸腺嘧啶释放后约14和34小时，双联蛋白水平升高，而p-组蛋白H3水平在释放后24和44小时达到峰值(图5)。

图5。同步PC-3细胞中Geminin和p-组蛋白H3的时间关系。双胸腺嘧啶阻滞同步PC-3细胞释放后定时固定。固定细胞平行孔分别用特异性抗geminin和p-组蛋白H3的兔单克隆抗体染色。荧光标记抗兔IgG抗体被用于可视化的特定目标。用Hoechst 33342反染细胞，鉴定细胞核。数据分析对使用10倍物镜制作的6 x 6蒙太奇图像进行。红色和蓝色箭头分别表示双联蛋白和p-组蛋白H3百分比峰值。数据点代表四个决定的平均值。

p-组蛋白H3 (ser 10)对有丝分裂细胞的特异性使其成为通过免疫染色评估细胞群有丝分裂指数的良好候选^[3]．只有处于有丝分裂中的细胞存在组蛋白H3上丝氨酸10的磷酸化修饰。这种蛋白修饰的细胞位于细胞核中，通过免疫染色和核反染色很容易识别(图6)。如图7所示，胸苷阻滞释放后，有丝分裂细胞的百分比显著增加。有趣的是，在不同的实验中，有丝分裂中细胞百分比的释放和峰值之间的时间延迟可能相差3-4小时。在两个实验中，同步的程度似乎是相似的。此外，当细胞经过第二轮有丝分裂时，观察到第二个有丝分裂指数峰值，观察到具有类似的时间关系，有丝分裂峰值水平之间的时间为20小时。

图6。p-组蛋白H3 PC-3细胞抗体染色。用抗p组蛋白H3抗体检测有丝分裂的PC-3细胞，用Hoechst 33342反染色鉴定细胞核。阳性核用红色示踪表示。

图7。不同同步实验PC-3细胞有丝分裂指数的比较。双胸腺嘧啶阻滞同步PC-3细胞释放后定时固定在两个单独的实验中。固定细胞用AlexaFluor 488标记的兔单克隆抗体特异性p组蛋白H3染色，用Hoechst 33342反染色并鉴定细胞核。数据分析对使用10倍物镜制作的6 x 6蒙太奇图像进行。空白减法后阳性核平均GFP信号大于10,000。每个数据点代表4个决定的平均值。

异步群体的有丝分裂指数可以用来确定细胞周期时间。以p-组蛋白H3作为有丝分裂的指标，图8显示了血清浓度对PC-3细胞异步居群有丝分裂指数的影响。从正常的10%血清下降到0.1%，24小时后有丝分裂指数从5.7%下降到3.6%。高于10%的血清有丝分裂指数不再增加(数据未显示)。据报道，组织培养中哺乳动物细胞有丝分裂的典型时间长度为60分钟^[4]．根据确定的有丝分裂指数和有丝分裂的长度，从观察到有丝分裂的概率计算出17.5小时的细胞周期长度(表2)。这与使用DNA含量或蛋白质表达确定的值非常一致。

图8。血清浓度对有丝分裂指数的影响。PC-3细胞用无血清培养基洗涤2次，用不同浓度胎牛血清培养基处理24小时。细胞固定后用兔抗组蛋白H3一抗处理。用AlexaFluor 488标记的山羊抗兔IgG二抗检测一抗。用Hoechst 33342反染法鉴定细胞核。数据点表示16个测定值的平均值和标准差。

表2。血清对异步培养PC-3细胞周期的影响。

在异步培养中，血清浓度影响PC-3细胞培养周期的长度。血清浓度从10%到1%降低10倍，计算的细胞周期时间增加近2小时(11%)。进一步将血清浓度从1%降低到0.1%，细胞周期延长8小时。

结论

在细胞周期中，细胞生长的进程是一个高度调控的过程。为了研究细胞周期不同阶段的不同过程，人们开发了各种方法来同步细胞通过细胞周期，作为在每个阶段富集细胞的一种手段。在这些实验中，双胸苷阻滞用于G1/S边界期的细胞富集。释放后，它们转变为s期并开始复制核DNA，这被观察到为来自dsDNA特异性染料的荧光增加。在DNA完全复制的情况下，细胞含有的DNA总量是g1期的两倍，这反映在荧光增加了两倍。随着有丝分裂和细胞质分裂，DNA含量减半，每个子细胞恢复到G1。由于PC-3细胞的多倍体性，使用PC-3细胞会影响其同步程度。具有额外染色体的细胞将比具有正常染色体数的细胞具有更大程度的荧光。有了足够的染色体复制，G1期(前s期)的细胞可以含有足够多的DNA，根据核含量将其解释为G2期。这可以在图2中观察到，根据核含量，胸苷阻滞释放的细胞中有近20%被标记为G2。

结论细胞生长在细胞周期内是一个高度调控的过程。为了研究细胞周期不同阶段的不同过程，人们开发了各种方法来同步细胞通过细胞周期，作为在每个阶段富集细胞的一种手段。在这些实验中，双胸苷阻滞用于G1/S边界期的细胞富集。释放后，它们转变为s期并开始复制核DNA，这被观察到为来自dsDNA特异性染料的荧光增加。在DNA完全复制的情况下，细胞含有的DNA总量是g1期的两倍，这反映在荧光增加了两倍。随着有丝分裂和细胞质分裂，DNA含量减半，每个子细胞恢复到G1。由于PC-3细胞的多倍体性，使用PC-3细胞会影响其同步程度。具有额外染色体的细胞将比具有正常染色体数的细胞具有更大程度的荧光。有了足够的染色体复制，G1期(前s期)的细胞可以含有足够多的DNA，根据核含量将其解释为G2期。这可以在图2中观察到，根据核含量，胸苷阻滞释放的细胞中有近20%被标记为G2。

BioSpa™系统与液体处理剂、Cytation™5和Gen5™Microplate Reader和Imager软件相结合，是价值和性能的理想组合。BioSpa系统保持环境温度控制，CO₂以及实验期间的湿度。在不同的时间间隔内，该系统将一个培养皿输送到液体处理程序中，以去除介质，添加固定剂并用PBS清洗，通过荧光染色捕获细胞的快照。在实验完成时，将多个板作为一组染色，并使用Cytation 5成像。Cytation 5能够制作多个图像以形成蒙太奇，允许对每个孔进行更大的细胞采样。在分析之前，将多个瓦片拼接到单个图像文件中。图像预处理去除背景，在物体识别之前消除任何井与井之间的差异。对象信息的Gen5直方图分析允许研究人员根据核染色直观地应用阈值门来定义G1和G2种群。快速检查多口井可用于确认拟合的好坏。然后计算并报告每个亚种群的百分比。通过抗体染色鉴定特异性蛋白可以与DNA评估同时进行分析。

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