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全玻片成像(WSI)时感兴趣区域的检测和自动成像

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2020年5月15日


作者: Peter J. Brescia，应用科学家，BioTek Instruments, Inc.， Winooski, VT

摘要

在当今的研究和临床环境中，全载片成像(WSI)是一种将安装在传统显微镜载片或各种样品容器上的物理标本转换为数字媒体的手段。一旦数字化，数据就可以很容易地存储为共享资源，用于各种目的，包括病理、诊断，以及作为科学研究和教育工具。数字格式可以通过传统的人工方法和日益强大的计算算法进行分析。增强显微镜允许发展流线型的方法，以定位感兴趣的区域(roi)在载玻片上，在微孔或在给定的样品。一旦选择了roi，将根据需要使用一系列可用的成像方法和后续的自动图像分析执行自动图像采集。

简介

自从17世纪安东尼·范·列文虎克(Antonie Van Leeuwenhoek)研制出第一批可视化微观物体的仪器以来，人们一直致力于改进捕捉和分析这些物体的方法1．虽然最初的图像是手绘的，其中一些非常精细，但在20世纪下半叶，技术的进步使数字成像和随后的计算机化分析方法成为可能2．样本种类跨越了不同的生物和物理领域，包括在临床环境中为诊断而获得的组织，跨学科和组织的基础研究项目中的样本，以及适合教育和/或合作目的的样本3.．分析包括一系列可观察参数的量化，如物体计数和物体大小的量化，以及更具挑战性的指标，如多通道荧光图像中物体的面积、像素强度和亚种群分析。此外，与传统的人工分析相比，数字图像提供了一种方法，可以以更精确、更可再现和更客观的方式对现有的一些信息进行标准化和自动化分析2．

在世纪之交，随着快速图像采集和数据管理解决方案的改进，玻璃载玻片的全载玻片成像(WSI)开始得到更广泛的接受4．这一发展的主要驱动力是传统组织学切片的数字化，可以通过计算机显示器或移动设备查看临床病理学2．特别是,缓解常规图像分析的标准筛选的负担将大大增加样品处理量3.．然而，这种技术的应用非常广泛，在学术研究、药物发现和开发项目以及生物技术公司都有价值。目标是简化工作流通过快速识别感兴趣的区域(roi)使用一个低放大率图像采集的光学路径选择地区更高的放大倍数。

ROI特征可用于扫描包含一个或多个组织切片的彩色亮场(CBF)切片，例如H&E染色组织切片或活检核心。通过扫描荧光标记的组织切片，并使用一个或多个通道在更高的放大倍率下对这些roi成像，例如用于生物标志物的评估和量化，其有效性得到了扩展4．此外，更传统的成像模式，如CBF、亮场和相位对比，可以与荧光通道结合，产生丰富的数据集。这里提供了两个使用组合直立和倒置自动图像采集系统的示例，在适用的情况下使用roi执行WSI。

全滑动成像(WSI)。

图1所示。全滑动成像(WSI)。立式相机和光学系统可以在低倍率的情况下，快速地将大量样品装在一个玻片上成像。感兴趣的区域(roi)被识别出来，随后在更高的放大倍数下成像进行分析。

材料和方法

仪表

2022年世界杯抽签 细胞成像多模式阅读器结合了自动数字垂直和倒置广角显微镜与传统的多模式微板阅读在一个独特的专利设计。倒置显微镜模块在荧光、亮场和彩色亮场中提供1.25倍至60倍放大的样品可视化，适用于广泛的应用。带有反射光成像的直立显微镜模块可以实现更多的应用，如ELISpot或快速滑动扫描和ROI检测工作流程。Cytation 7包括连续可变带通单色仪，适用于通用多模板读取器的多功能性和性能。温度控制到45°C，可选的Peltier冷却模块，气体控制和震动扩展了基于动力学细胞的分析的应用。细胞7由Gen5™软件，它结合了易用性和强大的处理和分析能力。
立式和倒置显微镜提供了广泛的放大范围(1.25x-60x)。
图2。Cytation 7。立式和倒置显微镜提供了广泛的放大范围(1.25x-60x)。正直的人,低放大光路用于整个幻灯片成像(WSI)。倒置显微镜用于图像感兴趣的区域(roi)在较高放大使用各种成像方法(例如,相衬,这项工作,颜色brightfield,等等)。

方法

胃组织，H&E染色(Carolina Biol;供应公司，伯灵顿，北卡罗来纳州，美国)。人类前列腺组织微阵列，H&E染色(癌症)PN: NBP2-30169 (Novus biotechnology Europe, Abingdon, UK)。胃组织WSI在2倍放大、4 × 4蒙太奇下进行，通过cyation™7中的直立数字显微镜使用透射彩色亮场来可视化和选择roi。选取3个roi，采用倒置WFOV数字显微镜彩色亮场10倍放大成像。在2倍放大、3 × 5蒙太奇下对微阵列进行WSI，利用透射彩色亮场，通过直立数码显微镜对roi进行可视化和选择。选取50例roi，采用倒置WFOV显微镜彩色亮场10倍放大成像。

结果

人类前列腺组织微阵列

包含40个组织学分级(Gleason评分)为6-10级的腺癌样本的前列腺组织核芯片和9个匹配的正常组织样本，来自44岁到75岁之间的患者，进行H&E染色进行成像。样品芯直径为2.0 mm，截面厚度为4 μm，排列在5 × 10的基体中。使用表1中列出的参数进行初始WSI，生成一个比包含组织核的区域略大的单个大的低分辨率图像。为每个核选择roi，以最小化背景区域的成像。随后，利用表1中列出的参数在10倍放大下对roi进行成像，每个样本核得到50组独特的平铺图像(3x3蒙太奇);49个前列腺组织样本和一个碳定位标记。使用自动图像拼接将这些图像处理成一张图像，生成50张单独的图像，用于未来的分析和存档(图3)。
细胞7成像设置。
表1。细胞7成像设置。
人类前列腺组织微阵列。
图3。人类前列腺组织微阵列。(a)微阵列低分辨率图像，(b)使用WFOV相机在10倍放大下拼接的3x3前列腺腺癌蒙大奇图像，(c)如上所述正常匹配的前列腺组织的代表图像。

哺乳动物胃组织:心脏，胃底和幽门区

取胃心、胃底和胃幽门3个组织切片，厚度约4 μm，放置于18 mm圆形盖套下。使用表1中列出的参数进行初始WSI，生成一个比覆盖层略大的区域的单个大的、低分辨率的图像。选择每个组织切片的roi以最小化背景面积，并使用表1中列出的参数以更高分辨率成像，从而分别为心脏、眼底和幽门区生成三组独特的平片图像(3x6、2x4和3x7蒙太奇)。使用自动图像拼接将平铺图像拼接成单个图像，生成三个独立的图像，用于未来的分析和归档(图4)。
哺乳动物胃:心脏，胃底和幽门区。
图4．哺乳动物胃:心脏，胃底和幽门区。(a)组织样本的低分辨率图像，(b) ROI的选择，(c) 10倍放大的ROI拼接图像，(d)代表高分辨率拼接图像的放大区域。

讨论

数字化捕捉图像的能力导致了范式的转变，简化了诊断、教育和基础科学研究的工作流程和共享。自动化成像解决方案通过提供快速全切片成像(WSI)或其他各种血管类型，进一步扩展了功能，以确定感兴趣的区域(roi)，以便后续进行更高分辨率的成像和分析。此外，包括多种成像模式，如彩色亮场，相位对比和表观荧光显微镜极大地扩展了可能的应用范围。这里展示的两个例子——前列腺组织核心和胃组织切片彩色亮场成像——展示了在低分辨率下快速成像整个血管表面的能力，只选择那些感兴趣的区域，并使用自动成像方法捕获roi的高分辨率图像。

这产生了一个功能强大的系统，当与基于图像的计算分析工具相结合时，提供了一个增加样本吞吐量的可行解决方案。

参考文献

  1. Meijer GA, Beliën JA, van Diest PJ, Baak JP。临床病理学影像分析的起源。中国中草药。1997;50:365 - 70。
  2. Aeffner Famke;马克·d·Zarella;Buchbinder,内森;Bui,玛丽莲·m·;马修·r·古德曼;哈特曼,道格拉斯j . et al .(2019):介绍数字图像分析在整场幻灯片成像:数字病理学协会的一份白皮书。病理信息杂志》10。DOI: 10.4103 / jpi.jpi_82_18。
  3. Gurcan Metin n;。劳拉e;可以,阿里;Madabhushi Anant;纳西尔·m·Rajpoot;Yener, B.(2009):组织病理学图像分析:综述。见IEEE生物医学工程评论2,147-171页。DOI: 10.1109 / RBME.2009.2034865。
  4. 马克·d·Zarella;道格拉斯·鲍曼;Famke Aeffner;Navid Farahani;艾伯特Xthona;Syeda Fatima Absar等人(2019):整个幻灯片成像的实用指南。数字病理学协会的白皮书。Arch Pathol Lab Med 143, 222-234页。
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