高通量微板双荧光素酶分析技术的比较分析

作者: Peter J. Brescia, Jr.和Peter Banks, BioTek Instruments, Inc.， Winooski, VT USA;艾米Landreman,Promega集团。麦迪逊，美国威斯康星州

荧光素酶通常被纳入基因报告系统，用于评估真核基因表达。通常在双荧光素酶检测格式中使用两种具有不同底物亲和性的荧光素酶变体的组合。通常情况下，一个荧光素酶作为实验报告来测量生物反应，而另一个是用于规范化数据的组成表达分析对照。鉴于在大多数实验系统中看到的极低的背景信号，一些荧光素酶变体已经开发出了广泛的动态范围和优秀的灵敏度。荧光素酶的活性通常以两种方式之一进行，结果要么是短的、强烈的信号，要么是长时间的、更温和的信号，分别称为闪光或辉光型检测。目前几种可用的双荧光素酶检测技术利用不同的荧光素酶变体，在一系列的微板阅读器上使用自动化方法进行了高通量筛选微板格式的研究。

简介

在过去的几十年里，基于荧光素的检测的重要性已经得到了很好的证明¹．随着基因工程工具的出现，荧光素酶基因构建物现在被常规地插入有机体或转染细胞，在那里它们作为基因活性的报告者²．这涉及到荧光素酶基因在转录启动子控制下的遗传构造的生成。在激活目标启动子后，可以测量活性。相反，在组成表达启动子的控制下，荧光素酶基础活性的任何扰动都可以为该基因的转录控制机制提供见解。这些研究包括受体活性、转录因子结合、mRNA处理、蛋白质折叠和检测细胞ATP水平。

在许多情况下，采用双荧光素酶检测格式，其中一个荧光素酶变体作为实验报告者，另一个作为对照报告者。实验报告允许被研究生物效应的相关性，而对照则用于规范化数据，消除由于实验因素(如转染效率、细胞活力和细胞数量)以及物理条件(如温度和时间的差异)造成的变异¹．通常，两个报告物中的一个发光信号由添加底物启动，测量，然后进行淬火反应和第二个报告物信号的启动，以实现均匀的检测格式。

高通量筛选经常使用荧光素酶报告分析，以评估化合物对感兴趣的靶通路的影响，因为可自动添加试剂，快速和可量化的分析读出，信号动力学与批处理兼容，并与高通量微板格式兼容。然而，由于信号强度较低，变异风险增加，将荧光素酶检测扩展到更高密度格式可能具有挑战性。此外，对于双荧光素酶测定，精确测量第二个报告蛋白所需的猝灭可能会因在高密度微板中实现充分混合的难度增加而受到阻碍。适当的淬火在很大程度上取决于诸如板的类型、试剂的分配方法、板的摇动的类型和数量等变量。

在这里，我们研究了几种荧光素酶变体和适用于高通量筛选(HTS)兼容的384孔格式的分析格式在一系列兼容microplate阅读器上的性能。

背景

基因报告系统长期以来一直被用于研究真核生物基因表达和细胞生理对环境刺激响应的调控机制。报告基因的构建需要在报告基因上游插入目标调控元件，然后使用遗传方法将其并入宿主细胞或并入质粒并转染到宿主细胞。许多应用程序都利用了报告系统。

生物发光是一种光子发射的酶氧化反应，在不同的生物体中通过一种被称为荧光素酶的泛类酶发生。这类酶具有极低的背景信号和较宽的动态范围等特点，是细胞生理学研究的热门选择¹．最近，基于荧光素酶的试剂已经多样化，包括细胞活力、凋亡和代谢的量化^2、3．萤火虫(Photinus pyralis, Fluc)和Renilla (Renilla reniformis, Rluc)的荧光素酶分别为61和36 kDa，是基于荧光素酶的应用中的主要工作人员(图1)。自引入它们以来，人们从各种生物(主要来自海洋)中发现了荧光素酶，它们具有独特的特性，如分泌到细胞培养基中并提高稳定性。然而，在常规的细胞分析条件下，许多期望的特性，如明亮的发光和低背景，要么与快速衰变或底物不稳定或自发光相结合。此外，许多天然荧光素酶被发现为异多聚物，其大小从20 kDa到超过100 kDa，这使得它们太大或难以合并到以细胞为基础的检测系统中。因此，人们努力简化荧光素酶的结构，以产生一种小的、单体的、稳定的、具有明亮、扩展光产生能力的酶。

图1．萤火虫和Renilla荧光素酶催化的生物发光反应。

最近发表的有关深海虾(opplophorus)的荧光素酶的研究，强调了一种工程酶的发展及其相关底物，具有上述许多理想的特征3。工程荧光素酶是较小的催化亚基(Oluc-19)的稳定变体，来自异质异构的天然结构，被命名为NanoLuc®(NLuc)(图2)。NLuc与底物(腔肠嗪类似物呋喃嗪)耦合时，产生的光比Fluc或Rluc都要亮得多，光谱最大值为454 nm(图3)。其他所需特性包括与普通细胞基系统的良好兼容性^3.．

图2．不同荧光素酶相对大小的比较。

图3。NanoLuc荧光素酶催化的生物发光反应。

双荧光素酶测定法测定报告者荧光素酶活性，通常从单个样品中依次测定对照报告者和实验报告者。对照报告器允许在共转染的双报告器系统中对实验报告器发光进行归一化，以解释实验条件的差异(图4)。通常这是通过添加含有特定于单个荧光素酶种的底物的试剂来实现的，从而产生稳定的信号。信号被读取后，第二试剂被添加到样品中，导致该反应的猝灭，同时启动第二个荧光素酶反应。最大信号强度和持续时间取决于单个荧光素酶反应动力学。

图4。双报告分析系统。实验和控制报告向量转换到目标细胞。实验报告表达式随处理的不同而变化，而控制报告表达式则是构成性的，允许个体样本和实验之间的数据规范化。

材料与方法

双荧光素酶报告检测系统(Cat。不。E1910)， Dual-Glo®荧光素酶检测系统(Cat;不。E2920)，纳米glo®双荧光素酶®检测系统(Cat;不。N1610)， QuantiLum®重组荧光素酶(Cat。不。E1702)和纯化的NanoLuc®荧光素酶是Promega公司(Madison, WI)的礼物。Renilla Mulleri荧光素酶(Cat。 No. 312) was purchased from NanoLight Technologies (Pinetop, AZ). Corning 384-well microplates (Cat. No. 3572) were used for all experiments (Oneonta, NY).

在每个检测系统中，萤火虫荧光素酶在DMEM培养基中添加10%胎牛血清，并保持恒定浓度。将Renilla或NanoLuc荧光素酶稀释至适当浓度，并在添加10%胎牛血清的DMEM培养基中进行11点、1:10连续稀释(包括零点)。在给定的实验中，两种报告剂分别以2倍的浓度在10 μL的体积中加入，总样品体积为20 μL。在实验对照孔中，每2倍浓度添加10 μL荧光素酶培养基。首先在加入等量20 μL的适当试剂后测定萤火虫荧光素酶活性。在建议的潜伏期之后测量发光信号。为每个检测添加适当的Stop & Glo®试剂，20 μL，在适当的孵育期后测量实验报告活性。对于快速分析，在每个读取器中使用集成注射器进行试剂添加，然后在记录测量结果之前进行2秒延迟。对于Glo型分析，试剂是使用重复移液器手动分配的。在记录测量之前，在室温下，在轨道激振器上进行推荐的孵育期。 Following the initial read, the second reagent was dispensed and incubated as described above prior to reading.

结果

双荧光素酶报告检测系统

双荧光素酶报告者(DLR™)检测系统通常使用萤火虫(Fluc)作为实验报告者，Renilla (Rluc)作为对照。首先测量Fluc信号，然后测量Rluc信号。两种荧光素酶都表现出“闪光”动力学，提供非常明亮的信号和高灵敏度，半衰期短。在本例中，我们测试了由纯化的荧光素酶组成的简化系统，以说明Fluc高水平表达的性能。重复对照由单个纯化的荧光素酶添加到384孔的微板上。此外，Fluc的混合物，保持恒定的浓度50 nM，结合10点，1:2的Rluc序列稀释也被制备，以模拟典型的细胞为基础的检测系统。所有井都在适当的时间使用综合试剂注入器依次添加试剂。发光信号测量使用Synergy HTX或Synergy HTX (Lum)专用发光光学器件。

无论是否存在Rluc报告器，如图5所示(Fluc和带有Rluc的Fluc)，在样本中Fluc信号几乎相同，表明Rluc报告器对初始Fluc读取没有影响。加入Stop & Glo®试剂后，在两秒延迟后读取Rluc发光(只有Rluc或有Fluc淬火的Rluc)，结果从每个测试阅读器获得几乎相同的滴定曲线(图5)。为了评估检测性能，使用Fluc或仅含介质的空白井的48个重复数据点计算Z ' -因子。两种仪器的Z′-因子决定因子均为0.91，表明具有良好的测定性能。

图5。DLR检测系统。Fluc在50 nM的恒定浓度下单独或与10点1:2的Rluc序列稀释相结合，以模拟实验细胞为基础的系统。发光信号测量使用Synergy HTX或Synergy HTX专用发光光学(HTX Lum)。

通过比较Fluc信号在Stop & Glo®试剂添加前后的淬灭比，可以研究残余发光。尽管超过99%的Fluc信号被Stop & Glo试剂猝灭，但如图5所示，初始Fluc信号仍保留少量的残余发光。额外的背景信号也可能是由于非酶氧化引起的腔肠嗪自发光的结果。来自上述组合背景信号应该保持恒定，如果认为有必要，可以从Rluc测量中减去。为了进行对比分析，除了淬火比计算外，在整个研究过程中没有进行背景减法。Synergy HTX和HTX (Lum专用)仪器的淬灭比分别为1778和2972(图6)。观察到的差异主要是HTX (Lum专用)仪器中专用发光光学的灵敏度增加的结果，其测量值提高了约3倍，仅观察到轻微升高的背景能级。

图6。双荧光素酶淬灭比。淬灭比的确定方法是将加入底物后荧光素酶的发光信号与加入Stop & Glo®试剂后的发光信号分开。

Dual-Glo®荧光素酶检测系统

Dual-Glo®荧光素酶检测系统依赖于之前描述的两个相同的荧光素酶报告器。然而，该分析被设计为允许更高的通量过程，给出了相当稳定的发光信号的报告和均匀的分析格式(不需要洗涤或预处理)。第一试剂添加物包含裂解缓冲配方以及半衰期约为2小时的萤火虫荧光素酶底物。在384孔的HTS分析格式中，来自5 nM Fluc的发光信号在大约10分钟内达到最大信号强度(图7)。然后在t = 20分钟时加入Stop & Glo试剂，并进行轨道振荡3分钟，导致Fluc的发光猝灭，并为浓度为1 μM的Renilla萤光素酶提供底物。在此分析格式中，Fluc发光的猝灭在约100分钟内接近背景水平(图7)。

与96孔检测共振峰相比，延长的淬灭时间可能是由于在高密度的384孔微板格式中分配和混合小剂量试剂的固有困难。然而，Dual-Glo®Rluc反应的半衰期约为2小时，因此可以在所需的潜伏期后精确测量，使Fluc的发光信号充分淬灭到背景水平。

图7．Dual-Glo®荧光素酶检测系统。在加入衬底约20分钟后，在Synergy HTX上监测Fluc (5 nM)信号。在加入Fluc发光猝灭试剂和Rluc衬底(红色虚线)后监测Rluc (1 μM)信号。

考虑到荧光信号在测定法中的稳定性，我们在多个仪器上对单板进行了额外的测量，以评价测定法和比较读取器的性能。无论是Fluc和Rluc单独或Fluc的混合物存在1:10的Rluc系列稀释，制备四份。Fluc发光测量在加入衬底和摇晃约10分钟后进行，而Rluc测量在加入Stop & Glo试剂约80分钟后进行，摇晃约3分钟(图8)。

Z ' -因子值按上述描述计算，在Synergy™Neo2、Cytation™3和Synergy HTX Lum上进行的测定值分别为0.91、092和0.90。>0.5的Z′因子决定因素表明在所有被测试的读取器中具有良好的分析性能。

图8．双glo®荧光素酶检测系统的性能比较阅读器。在多个读取器上添加衬底后约10分钟测量了荧光。在Fluc淬火和ruluc衬底添加后约80分钟测量了ruluc的发光。

Nano-Glo®双荧光素酶报告检测系统

Nano-Glo®双荧光素酶(NanoDLR™)检测系统结合了双glo®检测所增加的信号稳定性和NanoLuc荧光素酶产生的明显更亮的发光信号。稳定发光型发光信号有~2小时的半衰期，这允许从多个仪器的相同样品中收集数据。类似于DLR和Dual-Glo®，Fluc信号首先被测量，然后是第二个报告器Nluc的猝灭和测量。在本研究中，Nluc从浓度0.25 nM开始进行11点1:10串联稀释，Fluc浓度降低到1 nM。

当使用相似的读取器参数时，信号强度与Dual-Glo®试验中看到的信号强度相当。与DLR和Dual-Glo®试验观察到的结果相反，在孵育10分钟后加入NanoDLR Stop & Glo®试剂后，NanoDLR显示Fluc信号几乎完全猝灭(图9)。Z ' -因子值计算如上所述，在Synergy Neo2、Cytation 3和Synergy HTX(仅Lum)上进行的测定分别为0.89、0.89和0.92。NanoDLR Stop & Glo®试剂的高效淬火也可以通过测试三种仪器的淬灭比(图10)来观察，其淬灭比大约是DLR和Dual-Glo®测定法观察到的3-5倍。

图9。Nano-Glo®DLR检测在阅读器上的性能比较。在多个读取器上添加衬底后约10分钟测量了荧光。在Fluc淬火和加入Nluc衬底后约10分钟测量Nluc发光

图10。纳米glo®荧光素酶测定系统淬灭比。通过在几种仪器上的测量确定了NLuc的淬火比。

结论

几种双荧光素酶分析格式的性能使用一系列的微板阅读器进行了研究。这些检测使用了几种荧光素酶变体，它们可以作为对照或实验报告，每种都提供了独特的特征。该比较包括双荧光素酶系统中的闪光和发光型发光信号，采用HTS, 384孔微板格式。对新开发的~ 16 kDa荧光素酶变体NLuc以及常用的Fluc和Rluc荧光素酶进行了测试。

>0.7的Z′-因子决定因素表明，所有检测格式和所有仪器的检测结果均具有优异的检测性能。然而，通过DLR和Dual-Glo®测定中初始Fluc读数完全淬火的滞后时间，可以观察到在384孔板中实现完全混合的挑战，从而限制了Rluc测量的灵敏度。当以高通量形式使用这些测定时，可以通过使用移液器和/或使用高频电磁激振器来改善混合。

纳米荧光素酶对萤火虫荧光素酶的有效抑制，加上纳米荧光素酶的高强度发光，使得纳米荧光素酶非常适合384井格式的研究。NanoDLR试验最大限度地提高了两种联合报告剂的检测灵敏度，也增强了试剂的稳定性。NanoDLR测定法和BioTek系列的微板读取器测试为双报告子测定法在高温ts研究中的使用提供了重大进展。

参考文献

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