结合动力学配体结合和三维肿瘤侵袭技术评估CXCR4抑制剂的药物停留时间和抗转移效果

作者: Brad Larson和Leonie Rieger, BioTek Instruments, Inc.， Winooski, VT;尼古拉斯·皮埃尔,西比奥美国公司.，贝德福德，马萨诸塞州;希拉里·谢尔曼,康宁公司，生命科学肯尼邦克，我

简介

转移，即癌细胞从原发肿瘤扩散到体内的继发部位，与约90%的癌症死亡有关¹．趋化因子受体如CXCR4和CCR7的表达与乳腺癌细胞的转移性密切相关。在体内，中和CXCR4及其已知配体SDF1-α (CXCL12)的相互作用可显著抑制乳腺癌细胞的转移和细胞迁移²．传统上，新制剂的发现一直以平衡条件下配体对受体的亲和力为指导，在很大程度上忽略了配体与受体相互作用的动力学方面。然而，随着证据的积累，人们开始意识到结合动力学的重要性^{3 4 5 6}这表明配体在体内的有效性可能与特定配体与其受体结合的时间(药物-靶点停留时间)有关。

同样，适当的体外细胞模型也一直缺乏，以准确评估新疗法抑制肿瘤侵袭的能力。体内肿瘤以多种细胞类型的三维(3D)团块形式存在，包括癌细胞和基质细胞⁷．因此，结合3D球形类型的细胞结构，包括共同培养的细胞类型形成一个类肿瘤，提供了一个比使用传统的二维(2D)格式在井底培养单个癌细胞更具有预测性的模型。

在这里，我们使用直接、均匀的配体结合试验和以动力学形式表达CXCR4的细胞系来检测各种CXCR4抑制剂的药物靶向停留时间。在3D肿瘤侵袭实验中进一步测试了该抑制剂面板，以确定该分子的CXCR4停留时间与抑制肿瘤侵袭的表型效应之间是否存在相关性。MDA-MB-231乳腺腺癌细胞，已知具有侵袭性，并从原发性乳腺脂肪垫瘤转移到肺⁸除了原代人真皮成纤维细胞外，也包括在内。细胞分析算法提供了对原始肿瘤样结构变化的精确量化，以及侵变瘤的发展。该组合提供了一个准确的，但易于使用的方法，以评估新的，潜在的抗转移药物的基于靶点和表型效应。

材料与方法

材料

细胞

低温贮藏Tag-lite®稳定表达CXCR4的HEK293细胞由Cisbio Assays (Bedford, MA)提供。表达GFP的MDA-MB-231细胞(目录号;AKR-211)从Cell Biolabs, Inc. (San Diego, CA)购买。表达RFP的新生儿皮肤成纤维细胞。cAP-0008RFP)购自Angio-Proteomie (Boston, MA)。两种细胞类型均在高级DMEM培养基(目录编号:12491-015)+胎牛血清(FBS)， 10%(目录编号:10437-028)和Pen- strep -谷氨酰胺，1x(目录编号:10378-016)中繁殖，各来自Life Technologies (Carlsbad, CA)。

实验组件

用于抑制剂动力学结合特性表征的SDF1-α-d2和所有标记试剂均由Cisbio Assays提供。重组人CXCL12/SDF-1 α(目录号350-NS-010)购自R&D Systems (Minneapolis, MN)。DMEM/F12, HEPES，无酚红培养基(目录号11039- 021)购于Life Technologies。Matrigel基底膜基质，无酚红(目录编号356237)采购于康宁生命科学公司(Corning, NY)。AMD 3100(目录号为3299)、AMD 3465(目录号为4179)、WZ 811(目录号为3951)、FC 131(目录号为4320)、IT1t(目录号为4596)和CTCE 9908(目录号为5130)从研发系统公司(Minneapolis, MN)采购。384孔小体积，白色，圆底，未处理微板(目录号3674)，用于所有配体结合实验，由康宁生命科学(Kennebunk, ME)捐赠。

Synergy™Neo多模式阅读器

Synergy Neo将基于过滤和单色的检测系统结合在一个紧凑的单元中。HTRF®认证阅读器使用高性能氙气闪光灯和双pmt在基于滤波器的光学中，当激励设置为340 nm时，同时检测检测的665 nm和620 nm荧光发射。双重试剂注入能力使动力学分析已知配体和竞争结合成为可能。将体积为10 μL的Tag-lite细胞注入已经包含配体和缓冲液的384孔板的孔中，开始每次动力学结合实验。

Cytation™5细胞成像多模式阅读器

Cytation 5是一种模块化的多模式微板阅读器，结合了自动数字显微镜和微板检测。细胞增殖5包括过滤和单色仪为基础的微板读数;显微镜模块提供荧光、亮场、彩色亮场和相位对比的高分辨率显微镜。Cytation 5特别强调活细胞测定，温度控制到65°C, CO₂/ O₂用于动力学分析的气体控制和双注射器。抖振和Gen5软件也是标配。该仪器用于成像球体，以及通过Matrigel矩阵的单个细胞入侵。

Tag-lite®受体配体结合检测

图1．Tag-lite®受体配体结合检测程序。

Tag-lite CXCR4检测依赖于一个全功能snap标签融合的CXCR4受体和荧光标记配体SDF1-α。由于均质性，结合试验可以及时准确地记录结合事件。利用莫图斯基方程和马汉方程可以推导出未标记化合物的动力学结合参数。

康宁®球形微板

康宁96孔黑色透明底部球形微板(编号4520)表面涂有超低附着表面，这是一种无细胞毒性的生物惰性共价键合水凝胶，可防止细胞附着。新颖的井眼几何形状有助于在每口井的中心形成球形。每个微板都包含一个光学透明的圆形底部，这是细胞成像的理想选择，以及一个黑色的，不透明的主体，防止串扰。所有三维肿瘤侵袭实验均使用该平板进行。

方法

动态绑定

关联速率常数

SDF1-α-d2 (kon,SDF1-α-d2)的结合速率常数是通过将CXCR4表达细胞(5000个/孔)置于SDF1-α-d2存在的环境中，并测量此后不同时间的特异性结合。总共测试了7个[SDF1-α-d2]，因此也可以计算平衡时的半饱和结合常数(K_{d, SDF1 -αd2}）.

解离速率常数

SDF1-α-d2 (koff,SDF1-α-d2)的解离速率常数是通过在先前的混合物中加入100倍摩尔量的过量AMD3100来确定的，这有效地阻止了SDF1-α-d2与受体的进一步结合。

抑制剂面板的动力学表征

不同CXCR4抑制剂的缔合和解离速率常数根据别处描述的动力学竞争结合协议进行了测试。所有实验数据均采用GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc.， San Diego, CA)进行分析。

抑制表型肿瘤侵袭

细胞制备和球形形成

采集MDA-MB-231和成纤维细胞，稀释至5.0 × 10浓度⁴细胞/mL在完全培养基中。这两个体积结合在一起形成2.5x10的最终浓度⁴细胞/mL为每种细胞类型。取100 μL细胞悬浮液移液至适当孔中。配药后，将板放置在37°C/5% CO₂．

基于图像的球体形成监测

球体的形成每24小时监测一次。将平板放入Cytation 5中，之前设置为37°C/5% CO₂使用Gen5和气体控制模块。使用亮场通道进行聚焦。典型的细胞聚集期为48小时。

入侵基质的制备

在球形形成完成后，从每个孔中取出70 μL完全培养基，用等体积的浸润培养基(无血清、无酚红培养基)洗涤，将球形板置于冰箱中冰上5分钟，冷却孔。Corning®Matrigel®Matrix, non - Red-Free，然后在冰上解冻，而未标记的SDF1-α在侵入培养基中稀释到20 ng/mL的浓度。SDF1-α在浸润培养基或基质中进一步稀释至10 ng/mL浓度。然后将CXCR4抑制剂在含有10ng /mL SDF1-α的稀释侵袭培养基和含有10ng /mL SDF1-α的基质中滴定至1x浓度。

在冰板状态下，每孔加入70 μL含有SDF1-α和抑制剂的浸润培养基。在每口井中添加100 μL含SDF1-α和抑制剂的基质作为覆盖层。在旋转斗式离心机中以300 x g的速度离心5分钟，该离心机先前设置为4°C用于球体定位，然后转移到37°C/5% CO₂培养1小时，开始凝胶形成。

肿瘤侵袭试验性能

使用4倍物镜，曝光设置优化为亮场，以及GFP和RFP荧光成像通道。按照优化流程，第0天进行自动化成像，并每24小时继续进行一次，以跟踪肿瘤侵袭。使用捕获的4x图像进行细胞分析，以跟踪CXCR4抑制剂存在或不存在时的侵袭。

结果与讨论

药物靶点停留时间测定

SDF1-α-d2标记配体的缔合动力学

最终的药物-靶点停留时间值考虑了未标记抑制剂和标记SDF1-α-d2配体的观察到的开和关率，并通过合并Motulsky和Mahan方程计算⁹．计算最终值的第一步是使用d2受体荧光标记配体的浓度范围为0-100 nM进行联合结合实验。结合过程进行了40分钟的动态监测。

图2。SDF1-α-d2的缔合图。观察到从含有SDF1-α-d2配体浓度在0-100 nM范围内的孔的HTRF比计算的结合曲线。从总比率中减去非特异性结合值以确定观察到的特异性结合。

结合随着时间的推移而增加，直到几分钟后达到稳定(图2)。在关联实验中，这种稳定取决于所使用的标记SDF1-α的浓度。浓度越高，高原越高。用Graph Pad Prism对曲线进行拟合，得到所有测试浓度或k的观察关联率值_{奥林匹克广播服务公司}．

K_d通过绘制与不同浓度的配体达到结合平衡后产生的htf比值来确定标记配体的值。

图3。SDF1-α-d2饱和结合曲线。当被测物[SDF1-α-d2]达到结合平衡时产生的htf比值。

在饱和结合实验中，增加标记SDF1-α的浓度导致结合增加。当没有进一步的结合可以被记录时，就得到饱和。在平衡或K_d为29 nM。

评估标记的SDF1-α配体是否遵循质量定律的作用也可以进行。如果系统遵循质量作用定律，则kobs随SDF1-α浓度的增加而线性增加。

图4。群体行动决定定律。根据[SDF1-α-d2]计算的kobs值图。

由于该曲线呈线性，R2值为>0.9，证明了SDF1-α配体具有质量作用规律。这允许使用Graph Pad Prism软件从线性回归线推导关联和分离速率常数。

实验发现或数学推导的速率常数值总结在表1中。kon、SDF1-α-d2和koff、SDF1-α-d2分别为0.001 nM-1。S-1和0.04 S-1。

表1．SDF1-α的动力学结合表征。

SDF1-α-d2标记配体的缔合动力学

在Motulsky和Mahan发展的理论中，在动力学关联实验中，一个未标记的竞争者与一个标记的配体共孵育。在这里，单浓度的SDF1-α-d2配体，25 nM，与多个浓度的未标记的SDF1-α竞争对手在CXCR4表达细胞存在的情况下共培养。随着时间的推移，监测标记配体的动力学结合。

图5。竞争性结合动力学。SDF1-α-d2配体在100、10或1 nM浓度的(A.)存在时，随时间变化的特异性结合HTRF比值图Amd 3100， (b)AMD 3465，或(c)IT1t。

通过对SDF1-α-d2动力学结合曲线的拟合，结合质量作用定律线性回归曲线，计算出koff (Min-1)值。最终停留时间(R)值可以用以下公式确定:

R = 1/_考夫

因此，具有较低科夫率的分子驻留在目标受体上的时间较长。

表2。SDF1-α竞争对手解离率和停留时间值。

从图5中的曲线形状，以及标记配体和未标记竞争者的停留时间值的比较(表2)，可以对各种竞争对手做出定性和定量的假设。首先，如果竞争对手比配体更快地脱离目标(R值更小)，如AMD 3100(图5A)所示，配体的特异性结合将缓慢而单调地在时间上接近其平衡。然而，当竞争者解离较慢(R值较大)时，配体的结合曲线由两个阶段组成，从典型的“超调”开始，然后下降，直到达到新的平衡。停留时间大于SDF1-α-d2配体的竞争者，如AMD 3465和IT1t(图5B和C)，在验证性表型3D肿瘤侵袭试验中可能表现出更强的抑制反应。

通过SDF1-α配体结合抑制阻断入侵

如前所述，CXCR4与其已知配体SDF1-α之间的相互作用的中断会损害乳腺癌的转移和细胞迁移2。因此，我们对CXCR4抑制剂面板进行表型评估，以确定是否可以检测到肿瘤迁移水平的变化，更重要的是，与SDF1-α-d2相比，驻留时间更长的化合物是否对通过3D基质的迁移具有更高的抑制作用。采用MDA-MB-231乳腺腺癌细胞与人真皮成纤维细胞共培养作为体外肿瘤模型。该乳腺癌细胞系此前已被证实表达CXCR4受体10。

图6。基于图像的MDA-MB-231/成纤维细胞肿瘤侵袭监测。使用AMD 3465、IT1t和CTCE 9908孵卵0天和5天后，使用4倍物镜捕获的光场和荧光图像叠加。成像通道表示:Brightfield -总细胞数和内嵌数;GFP - MDA-MB-231;RFP -成纤维细胞。

图7．浸润性肿瘤面积的量化:4倍叠加图像，在5天(a) 100 μM和(b) 0 μM IT1t与类肿瘤孵卵后捕获。Gen5使用以下标准自动绘制对象掩码:阈值:5000 RFU;最小物体尺寸:400 μm;Max。物体尺寸:1500 μm;图像平滑强度:0;背景压平大小:自动。

细胞分析使用Cytation 5使用亮场信号来量化浸润程度。物体的最小和最大尺寸，以及亮场阈值被设置，以便在每个肿瘤周围自动绘制精确的物体掩码(图7A和B)。在实验中评估的所有图像都使用相同的标准。这允许对每个待完成的对象掩码中覆盖的区域进行定量比较。

图8。肿瘤侵袭抑制测定。在抑制剂浓度存在的情况下，第0天和随后5天侵袭期的单个类肿瘤区域的图。

显示的4x图像(图6)和图8中的图表显示了潜伏期前后的总类肿瘤区域覆盖率，说明了CXCR4抑制剂阻断肿瘤侵袭的能力与之前确定的停留时间一致。AMD 3465和IT1t的停留时间比SDF1-α-d2长，能有效减少肿瘤侵袭，且呈剂量依赖性。MDAMB- 231 GFP和成纤维细胞RFP表达在100 μM IT1t孵育5天后出现下降，同样浓度的AMD 3465孵育7天后也出现下降(数据未显示)，可能也表明这些化合物的高剂量可对癌症和基质细胞产生慢性细胞毒性作用。所有其他化合物对类肿瘤在3D基质中的迁移能力几乎没有影响。虽然AMD3465和ITt1表现出相同的亚纳米摩尔效力，但由于AMD3465停留时间更长，因此作为CXCR4抑制剂普遍存在。

结论

Tag-lite CXCR4配体结合试验提供了一种简单但稳健的基于细胞的方法来确定已知受体配体的动力学结合，以及测试分子的竞争性结合。Synergy Neo的同时双发射捕获和注射能力允许精确计算动力学缔合和解离率，当与Tag-lite®检测结合使用时。康宁球形微板提供了一种易于使用、一致的方法来进行球形聚集和验证性3D肿瘤侵袭分析。cyation™5可以使用亮场或荧光通道对球形形成和浸润结构进行成像，从而轻松跟踪类肿瘤浸润。Gen5™数据分析软件灵活的细胞分析能力还允许在整个潜伏期内对三维肿瘤侵袭进行准确评估。分析化学、细胞模型、动力学微板和基于图像监测的结合，以及细胞分析提供了一种理想的方法，以更好地了解肿瘤侵袭和转移潜在抑制剂的靶向效应和表型效应。

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