用cADDis生物传感器和自动活细胞成像实时描述g -和gi依赖的cAMP水平调控

作者:乔·克莱顿博士安捷伦科技有限公司

摘要

第二信使cAMP参与多种细胞过程。Gs和Gi蛋白家族调节camp依赖的信号通路，以响应相关G蛋白偶联受体(GPCR)的激活。在这项研究中，动态活细胞成像被用来监测表达cAMP生物传感器的HEK293细胞中的cAMP水平，同时刺激D2, M2R和β2受体。此外，使用自动图像分析来描述随时间变化的cAMP水平的Gs和gi依赖性变化，并确定药理学剂量反应。

简介

gpcr介导的通路是细胞对细胞间和环境信号作出反应的关键，也是药物发现工作的主要焦点。^1、2GPCRs的刺激导致涉及相关G蛋白和第二信使水平调控的复杂和重叠的信号级联^3.(图1)。

g蛋白家族的激活通过腺苷酸环化酶(AC)刺激第二信使cAMP的产生。cAMP水平的升高反过来通过激活cAMP依赖的蛋白激酶来传播信号级联。相反，Gi家族蛋白的激活抑制AC活性，降低cAMP水平。camp依赖通路的这两个分支的相互作用调节细胞通信。⁴

来自Montana Molecular的cADDis生物传感器提供了一种替代测量cAMP在细胞裂解液中的积累，能够在不使用福斯科林的情况下测量Gs和Gi信号之间的动态相互作用。⁵本应用说明描述了使用安捷伦BioTek测量活细胞中cAMP水平随时间变化的基于成像的方法2022世界杯附加赛决赛狮心王外汇自动显微镜和石硅生物传感器。2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek Gen5自动化图像处理和分析工具提供了更大的检测窗口，并比依赖于总荧光强度测量的方法提高了灵敏度。双在线分配尖端和快速图像捕获率支持连续添加Gs和gi偶联受体激动剂，以详细描述camp依赖的信号通路。

图1所示。g蛋白偶联受体(GPCR)信号通路示意图。

材料与方法

2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek Lionheart FX自动显微镜

的狮心王外汇自动显微镜与增强显微镜是一个集成的显微镜系统，优化活细胞成像高达100倍的空气和油浸放大。亮场、彩色亮场、相位对比度、高对比度亮场和荧光通道为广泛的成像应用提供最大支持。独特的环境控制盖可孵化至40°C，并有效遏制CO₂/ O₂控制。可用的湿度室和双试剂注入器为活细胞成像工作流程增加了更大程度的环境优化。Gen5软件为广泛的活细胞和固定细胞应用提供自动图像捕获和分析。

图2。．2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek Lionheart FX自动显微镜，带有双试剂注入器模块和CO₂/ O₂控制器。

蒙大拿州分子碳酸钙生物传感器

Montana Molecular提供一系列荧光生物传感器用于研究GPCR激活。该生物传感器机制是基于循环排列的荧光蛋白，结合到特定的第二信使。原位向下循环AMP差异检测器(cADDis)绿色生物传感器显示出降低的荧光强度，以响应细胞内cAMP水平的增加。组成活性的g增加了Gi研究中cAMP的稳态水平，消除了forskolin的需要。钙可以与钙结合^{2 +}以及DAG传感器用于同步通路读出。BacMam传递系统能够在多种细胞类型(包括原代细胞和iPSCs)中实现一致和可控的表达。

转导和细胞电镀

HEK293在含10%胎牛血清和5% CO青霉素链霉素的高级DMEM中培养₂37°C。培养在80%合流时常规胰化(0.05%胰蛋白酶- edta)。细胞转导遵循Montana Molecular方案进行，体积优化为细胞密度和病毒滴度，以及所需的样品数量(图3)。简单地说，病毒转导反应(125 μL cADDis传感器，3 μL 500 mM丁酸钠，25 μL受体(D2或M2)， 25 μL组成活性Gs, 72 μL Advanced DMEM + 10% FBS和pen/strep)被添加到3.5 mL的70000个细胞/mL Advanced DMEM细胞悬液中。轻轻混合后，将150 μL的混合物每孔播种于Costar 3904 96孔微孔板中，然后盖上铝箔避光，在细胞培养罩中培养30分钟。然后将细胞转移到37°C的培养箱中，在正常细胞生长条件下培养24小时，以确保最佳的传感器表达。

图3．生物传感器细胞转导的蒙大拿州分子协议。

成像过程

为成像做准备，将培养基替换为100 μ L室温DPBS，让细胞在室温下适应20分钟，同时避光。然后将平板转移到Lionheart FX自动显微镜中，并在试剂注射器中注入Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) + 6倍终浓度激动剂或DPBS。

实验在室温下使用GFP 469/525 LED/滤波器立方体组和4倍物镜进行。聚焦使用激光自动对焦。曝光设置被优化，以显示表达细胞预兴奋的钙亚铁，同时足够低，以适应荧光随时间的显著增加。曝光设置如下:LED 9;积分时间100ms;获得0.6。图像以每秒0.2帧(FPS)的速度采集，持续330秒。试剂的添加由双试剂注射器进行，通过倾斜的注射尖端以225µL/秒的速度分配20µL。

图像处理和细胞分析

对具有自动设置的图像进行预处理。Gen5对象掩蔽功能可以识别成像场内的细胞。通过将阈值设置在刚好低于基线的石钙荧光下，这一特性被用于在细胞周围应用掩膜。推荐的细胞分析设置如表1所示。阈值将根据暴露设置和生物传感器表达水平而变化。对象和积分值用于所有数据缩减步骤。

表1。受体激活动力学剖面的图像预处理和细胞分析参数。预处理和对象掩码减少了背景，从而改进了分析和更大的分析窗口

结果与讨论

HEK293中gi偶联D2受体的定量激活

HEK293细胞表达向下的石钙生物传感器、D2受体和组成活性g，由于高cAMP水平，在基线时表现出低石钙荧光。通过添加0.1 μ M quinpirole刺激gi偶联D2受体可在5秒内增加石钙石荧光，并在330秒时间过程接近结束时达到稳定水平。使用归一化石酰亚胺荧光测量(F/F0)生成了一系列quinpirole浓度的动力学剖面。使用t = 300秒时的归一化荧光水平生成quinpirole剂量响应曲线，从而计算出EC₅₀值为2.7 nM(图4)。

图4。HEK293中gi偶联D2受体的定量激活。(A) HEK293表达绿色向下的石钙素传感器、D2受体和组成型活性g(上)，Agilent BioTek Gen5将掩膜放置在表达石钙素荧光的细胞周围，使其高于最小阈值(下)。2022世界杯附加赛决赛cADDis的荧光随着cAMP水平的降低而增加，由于基线时cAMP水平较高，因此最初较低(t = 0)。通过注射0.1 μ M(最终)quinpirole刺激gi偶联hD2受体，使cADDis荧光随着cAMP水平的降低而稳定增加(t = 1-3)。图像以0.2 fps的速度拍摄，持续330秒。(B)碳酸钙物体和积分荧光的动力学剖面(F/F₀， n = 8)，通过注射0.1 μ M quinpirole或DPBS激活gi偶联D2受体(虚线)。(C) Quinpirole剂量响应曲线(F/F₀在t = 300秒时，n = 4 /浓度)，计算EC₅₀价值。

描述了Gi和gs耦合调节cAMP水平之间的相互作用

活细胞中cAMP水平的动态监测揭示了Gi-和gs -依赖通路之间的动态相互作用。表达内源性β2肾上腺素能受体(β2AR)的HEK293细胞被绿色钙亚铁、M2受体(M2R)和组成型活性g转导。激活的gs偶联β2AR促进腺苷酸环化酶的活性，而激活的gi偶联M2R抑制cAMP的产生(图5)。

图5。g -和gi依赖通路对腺苷酸环化酶活性的调控。gs偶联β2AR和gi偶联M2R拮抗调节cAMP水平。

组成型活性g的表达导致细胞内cAMP水平升高，导致石钙石的荧光在基线时较低。在体系中加入30 μM(最终)卡巴醇刺激Gi通路，导致卡巴醇荧光持续增强。然而，用1 μM(最终)异丙肾上腺素刺激gs偶联β2AR，通过克服gi对腺苷酸环化酶的依赖性抑制，迅速将石钙石的荧光强度降低到接近基线值(图6A)。一种归一化的石钙体荧光随时间的剖面被用来量化Gi和gs介导的信号之间的相互作用。Gi的激发导致在添加卡巴醇后10秒内可检测到石钙的荧光增加，并在300秒内开始稳定在基线水平以上约2.5倍。随后加入1 μM异丙肾上腺素可在100秒内迅速将石钙的荧光降低到接近基线水平(图6B)。

图6。双试剂注射器能够通过连续添加M1R和β2受体激动剂来表征Gi和Gs的相互作用。(A) HEK293表达绿色向下的石钙素传感器、M2受体和组成型活性g(上面板)，Agilent BioTek Gen5将掩模放置在显示石钙素荧光超过最小阈值的细胞周围(下面板)。2022世界杯附加赛决赛由于基线时cAMP水平较高，石钙体的荧光最初较低(t=0)。添加30 μM(终值)卡巴醇可刺激Gi活性，降低cAMP，增加cADDis信号(t=1-2)。然而，通过1 μM(最终)异丙肾上腺素刺激gs耦合内源性β2AR, cADDis荧光迅速降低到接近基线(t=3)。(B)在Gi-和gs -偶联受体激活(虚线)作用下，石钙靶总和积分荧光随时间变化的剖面(F/F0, n=6)。

结论

这项研究证明了使用Agilent BioTek Lionheart FX自动显微镜和cADDis生物传感器对camp依赖信号通路进行可靠定量分析的能力。2022世界杯附加赛决赛基于图像的活细胞cAMP水平监测能够实时敏感地检测和表征GPCR激活，包括Gi和Gs信号通路之间的相互作用。虽然一些cAMP积累试验依赖于二萜forskolin，因为它能够放大Gs对腺苷酸环化酶的作用，但由于对生物信号的破坏作用，在上述试验中使用forskolin是不必要的，也不推荐使用。^{6 - 8}

虽然这里描述的所有实验都是在Lionheart FX上进行的，但每种分析也可以在安捷伦BioTek Cytation细胞成像多模式阅读器上进行。2022世界杯附加赛决赛这些仪器的快速图像捕获率和双试剂注射器可用于快速细胞反应的不间断监测。自动化安捷伦BioT2022世界杯附加赛决赛ek Gen5图像处理和细胞分析工具极大地减少了背景荧光，与依赖于总荧光强度测量的方法相比，提供了更大的检测窗口，并提高了灵活性和灵敏度。

参考文献

1. Yan, K.等，循环AMP信号通路:探索成功药物发现的靶点(综述)。Mol医学代表，2016年。13(5): p. 3715-23。
2. 拉帕诺，R.和M. Maggiolini, G蛋白偶联受体:癌症药物发现的新靶点。Nat Rev Drug discoverv, 2011。10(1): p. 47-60。
3. Fredriksson, R.和H.B. Schioth，全序列基因组中g蛋白偶联受体的保留库。Mol Pharmacol, 2005。67(5): p. 1414-25。
4. Simonds, w.f.， G蛋白对腺苷酸环化酶的调控。药理学，1999。20(2): p. 66-73。
5. Tewson, p.h.，等，新型DAG和cAMP传感器优化活细胞检测在自动化实验室。生物ol Screen, 2016。21(3): p. 298-305。
6. Dessauer, c.w.，等，V型腺苷酸环化酶上Gialpha结合位点的鉴定。生物化学杂志，1998。273(40): p. 25831-9。
7. Hoshi, T.， S.S. Garber和R.W. Aldrich，福斯科林对电压门控K+通道的影响与腺苷酸环化酶激活无关。科学,1988。240(4859):第1652-5页。
8. Wagoner, P.K.和B.S. Pallotta，福斯科林对乙酰胆碱受体脱敏的调节与cAMP无关。科学,1988。240(4859):第1655-7页。