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用多模微板阅读器对LAMP分析的表征

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2021年9月15日

使用安捷伦BioTe2022世界杯附加赛决赛k Synergy Neo2混合多模式阅读器动态监测LAMP试验

作者: Paul Held，博士，安捷伦科技公司

摘要

在过去的20年里，等温核酸扩增检测，如环介导等温扩增(LAMP)已经成为一种重要的诊断工具，不仅用于临床应用，还用于食品质量控制和环境监测。LAMP是一种检测技术，因其在许多不同条件下检测核酸序列的能力而受到关注，无需专门的设备。虽然通常在PCR管中作为终点反应运行，使用人工观察阳性/阴性的测定，但使用比色pH变化检测有助于自动动力学监测。本应用笔记描述了基于PCR管的检测方法对微板的适应性以及安捷伦BioTek的后续使用2022世界杯附加赛决赛协同Neo2多模式读取器，在384孔微板中以低容量运行LAMP分析。

简介

环介导等温扩增(LAMP)是一种利用Bst DNA聚合酶大片段的自循环和链位移DNA合成扩增方法。1LAMP使用4-6引物识别目标DNA的多个不同区域，进行高度特异性的扩增反应。产物通常乐鱼平台入口相当长，目标扩增是如此广泛，许多不同的检测模式是可能的。实时荧光检测使用插层染料或直接探针，以及琼脂糖凝胶电泳可用于解释LAMP反应。LAMP是如此多产，这些反应的产物和副产物也可以用眼睛看到乐鱼平台入口。例如，反应过程中产生的焦磷酸镁可以被观察到为白色沉淀物，或者添加的指标如钙蛋白或羟基萘酚蓝可用于指示阳性反应。2、3该反应还会引起明显的pH值变化，可以用pH指示染料检测到。4

LAMP采用两个外引物(前向外引物F3和后向外引物B3)，两个内引物(前向内引物FIP和后向内引物BIP)和一个具有链置换活性的DNA聚合酶如图1所示，内部引物FIP(它包含了两个针对模板DNA中两个不同区域的目标序列)最初与目标DNA杂交，并开始互补链合成(I)。外部引物F3开始对拉长的FIP引物进行链置换，释放单链DNA (ssDNA)，作为后向引物(II)的模板。BIP引物在ssDNA上开始合成链，随后被B3引物(III)取代。3 '端和5 '端都与进一步向内的序列互补，形成茎-环DNA结构(IV和V)。茎-环结构是指数扩增的起点。自吸和其3 '端(F1和B1)的延伸诱导5 '端(F1c和B1c)的位移，随后的发夹结构展开和新合成链的后折叠。重复的自吸通路产生长花椰菜样结构的扩增子。1

LAMP放大示意图。正向和反向内部引物靶向并复制特定的分析物DNA序列，以及通过引物扩展创建循环结构。

图1所示。LAMP放大示意图。正向和反向内部引物靶向并复制特定的分析物DNA序列，以及通过引物扩展创建循环结构。生成的环序列的后续放大是指数级的。


当DNA聚合酶将一个脱氧核苷三磷酸结合到新生的DNA中时，如图2所示，释放的副产物包括焦磷酸部分和一个氢离子。乐鱼平台入口DNA聚合是一个能量上有利的反应，因为核苷掺入聚合物后焦磷酸盐水解当反应混合物的缓冲能力很小或没有缓冲能力时，pH值最终会变成酸性。Bst聚合酶已被证明对pH值的变化具有耐受性。1

核苷酸聚合成DNA

图2。核苷酸聚合成DNA。核苷三磷酸在使用互补链作为模板的聚合酶的作用下被聚合成DNA聚合物。核苷酸并入聚合物的结果是糖-磷酸基的形成和一个焦磷酸盐和一个氢离子的释放。

实验

2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek Synergy Neo2混合多模式阅读器

在LAM2022世界杯附加赛决赛P检测孵育之前，Agilent BioTek Synergy Neo2混合多模式阅读器预热至65°C 1小时。比色LAMP反应在最终反应体积为5 μL的条件下进行。根据制造商说明使用New England Biolabs (Ipswich, MA) LAMP检测试剂盒组分(p/n E2019S)的浓度。样品、主混合物、引物、盐酸胍、无核酸酶水和模板预混在1.5 ml的epppendorf管中，转移到来自康宁(Corning, NY)的透明底、黑面384孔板(p/n 3542)，用来自Greiner Bio-One北美公司(Monroe, NC)的qPCR密封剂(p/n 676040)密封，在300 g的条件下离心1分钟。离心后，使用Synergy Neo2上的波长开关每1.5分钟读取一次样品。

结果与讨论

含ph敏感染料(酚红)的LAMP测定法的吸收光谱随时间变化显著，如图3所示。随着反应的进行，在560 nm处有一个明显的吸光度峰逐渐减小，而在420 nm处出现一个较小的吸光度峰。

LAMP实验反应在不同时间的吸收光谱

图3。LAMP实验反应在不同时间的吸收光谱。在LAMP试验开始后的不同时间测定300 ~ 700 nm波长的吸光度(以1 nm增量为单位)。数据代表两口独立井的平均值。

LAMP分析过程中吸收光谱的变化与苯酚红在不同pH值下光谱曲线的吸收变化相关。如图4所示，随着苯酚红溶液的酸化，苯酚红在560 nm处的吸光度峰减小，而在415 ~ 420 nm处的一个较宽的吸光度峰增大。酚红的颜色变化通常用于组织培养基，作为培养基完整性的指标。当哺乳动物细胞在培养中生长和分裂时，培养基成分的消耗和废物的产生导致培养基酸化，导致培养基变黄。乐鱼平台入口420 nm和560 nm吸收峰的比值以前曾用于评估在各种条件下组织培养的pH状态。6
苯酚红在不同pH值下的吸收光谱

图4。苯酚红在不同pH值下的吸收光谱。用一系列100mm磷酸盐缓冲液将苯酚红稀释到最终浓度为15mg /mL。用箭头表示波长峰值的变化值。数据表示每个pH值的三条光谱曲线的平均值。

DNA聚合产生氢离子作为副产物，导致含酚红反应的颜色发生变化。因此，LAMP反应可以使用420:560的比例进行监测。随着更多的核苷酸被加入到DNA聚合物中，随后产生的氢离子会导致反应混合物更大程度的酸化。由于LAMP反应的特异性，随着时间的推移，只有导致DNA扩增的样品才会使反应酸化。如图5所示，只有阳性样本会随着时间的推移导致420:560的比例发生显著变化。随着平板和样品的加热，观察到所有样品的比例略有增加，但在约26分钟时，反应的放大产物导致420:560的比例显著增加，最终达到稳定状态。乐鱼平台入口阴性对照(缺少DNA靶点)和内对照(包含目标序列，但引物不合适)均未产生扩增产物，420:560比变化不大。乐鱼平台入口

LAMP试验的动力学测定超过60分钟。

图5。LAMP试验的动力学测定超过60分钟。数据显示为420 nm和560 nm吸光度值的比值(420:560)。阳性反应阈值比率值用虚线表示。这些数据代表了八种测定方法的平均值和标准差。

较低浓度的目标序列的反应需要较长的时间来观察反应pH值的显著变化，以420:560的比率监测。如图6所示，当阳性对照样品被稀释时，比值的快速增长被延迟。使用420:560比例的任意截止值1.1，很明显，未稀释对照比1:10稀释更早达到该值。同样，稀释1:100和1:100的样品需要更长的时间才能达到阈值。

靶浓度对LAMP检测结果的影响

图6。靶浓度对LAMP检测结果的影响。阳性对照样品稀释超过三个数量级，并用LAMP反应进行测定。数据显示为420 nm和560 nm吸光度值的比值(420:560)。阳性反应阈值比率值用虚线表示。这些数据代表了八种测定方法的平均值和标准差。

使用安捷伦BioTe2022世界杯附加赛决赛kGen5microplate阅读器和成像软件，达到一个定义的阈值的时间(称为“OD起始时间”)可以被监控，并用于进一步的数据精简。在这些反应中，阳性对照是含有已知拷贝数的目标序列的pucc衍生DNA质粒。如图7所示，当Time to Onset OD与起始目标浓度作比时，达到比率阈值所需的时间长度随着目标拷贝数的减少而增加。

靶浓度对起效时间的影响。

图7。靶浓度对起效时间的影响。根据图6所示的数据计算达到420:560比值为1.1所需的时间，并绘制为LAMP分析目标拷贝数的函数。这些数据代表了八种测定方法的平均值和标准差。


初步结果表明，pH值的变化可以用于监测核酸扩增使用pH敏感性比色染料，如苯酚红。反应混合物的光谱扫描显示，560 nm的吸光度峰消失，而以420 nm为中心的吸光度峰增加。这表明，随着阳性样品LAMP反应的进行，核苷酸三磷酸被纳入DNA聚合物中，随后氢离子的释放导致反应混合物变为酸性。

这些数据表明，LAMP核酸扩增试验可以使用420 nm和560 nm吸光度值的比值进行监测。使用Synergy Neo2多模式阅读器，在开始检测约26分钟后，可以观察到420:560的比例显著增加。阴性对照(缺乏靶DNA或引物不适当)不会导致比值值的快速上升。含有较少起始目标的样本通常显示420:560比率的增加，然而，与真阳性对照相比，这种情况在较晚的时间出现。绘制达到比率阈值的时间，虽然不是真正定量的，但确实提供了目标浓度的相对指示。虽然LAMP的灵敏度已被报道与使用荧光检测的PCR相似，但使用可视的pH比色变化是不有效的。使用基于ph值的吸光度变化，不能可靠地检测到低于400拷贝的目标拷贝数。

聚合酶链式反应(PCR)一直是核酸扩增的主要手段。虽然这项技术被广泛应用，但它需要热循环设备和一些放大检测机制，通过实时监测(如荧光)或反应后电泳。与PCR相比，LAMP检测是基于一个Bst而不是Taq聚合酶。Bst聚合酶具有链置换活性，工作温度为60 ~ 72°C，这意味着LAMP实验可以在等温条件下进行。7这种场景对于平板阅读器来说是理想的，前提是它们能够达到良好的温度均匀性。由于不需要循环温度，缩短了实验运行时间。最近的修改Bst聚合酶(Bst2.0)提高了逆转录酶的活性，允许用一种酶扩增RNA序列。2

以420和560 nm的吸光度作为检测方案，有几种方法可以评估比色LAMP分析的进展。420 nm吸光度值的增加表明颜色从红色变为黄色，pH值下降到7以下。然而，峰值振幅的增加是适度的，只有在较长的孵育时间内吸光度值才会发生显著的变化。420:560比率的使用放大了信号变化，从而更容易和更可靠的检测。在本研究中，使用阈值或时间来实现阈值420:560的比率值比使用最大变化(MaxV)或时间来实现MaxV计算更具有预测性。所有样品，包括阴性对照，其吸光度值都有一定程度的变化。因此，它们也有最大的变化值，尽管相对于阳性反应通常较小，并且区分阳性和阴性样本是有问题的。

最终，即使是阴性样本也会产生足够的扩增产物，以达到420:560的比例阈值。乐鱼平台入口伪扩增产物是LAMP分析中一个公认的现象。乐鱼平台入口8由于这个原因，以及仪器的简单性，LAMP试验通常作为一个终点反应运行，在规定的时间结束时确定结果。在本应用说明中，Synergy Neo2用于动态运行检测，因为这提供了更多有关检测性能的信息。为此，可以在有限的时间内进行动力学分析，或者将动力学分析限制在总动力学运行的一部分。后一种方法允许研究人员观察更多的数据，即使这些数据最终没有被使用。Gen5中的动力学分析数据缩减功能提供了将分析设置为查看整个数据集或将其限制为总动力学运行中的有限数据集的方法。

结论

安捷伦B2022世界杯附加赛决赛ioTek高温读取器，如Synergy Neo2，是在65°C下运行比色LAMP测定的理想平台。这些读取器提供高温孵化与均匀加热整个板。板的顶部和底部之间的温度梯度可以被编程，以消除板密封底部的冷凝。ph值随时间变化的实时测量使用户在开发新的分析方法时相信数据是准确和有意义的，以及了解最佳截止点的方法。安捷伦B2022世界杯附加赛决赛ioTek Gen5多模读取器和成像软件提供了读取器控制和波长比和时间到起始值的自动计算，允许用户轻松区分阳性和阴性控制。Synergy Neo2波长切换允许在420 nm和560 nm进行实时检测。在microplate阅读器上使用LAMP检测，用户可以在40分钟内检测样品，使该技术非常适合作为高通量诊断工具。

参考文献

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  3. Goto, M;本田、大肠;Ogura大肠;野本,a;Hanaki K-I。羟基萘酚蓝比色法检测环介导等温扩增反应。生物技术，2018,46(3):167-172。
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