使用3D PrimeSurface®超低附着微板进行亮场和荧光成像

作者:Brad Larson, BioTek Instruments, Inc.， Winooski, VT美国;安居见鬼,S-BIO哈德逊，美国新罕布什尔州

摘要

三维(3D)细胞培养已成为一种成熟的体外实验方法，因为它提供了一种改进的类活体环境。透明U底超低附着微板的使用减少细胞粘附已成为应用如球形增殖的标准。这里显示的结果证明了使用亮场和荧光显微镜产生高质量结果的能力。

简介

三维(3D)培养细胞已经成为一种成熟的方法，因为它比传统的二维(2D)培养更能代表体内环境。让细胞在一个球体中相互作用，创造了一个模拟体内组织的微环境，是检验药物对癌症疗效的更好模型。开发均匀的球体变得特别重要，因为它形成了稳健和可靠的分析的基础。S-BIO PrimeSurface®培养器皿是超低附着(ULA)盘子和盘子，促进支架自由，自组装球形形成。这些板被预先涂上了一种专有的亲水性聚合物，可以自发形成均匀大小的球体。PrimeSurface 96和384 ULA板具有良好的光学清晰度，使它们非常适合亮场和荧光成像。成像技术，如BioTek2022世界杯南美区预选赛 允许研究人员不仅通过亮场成像来研究球形增殖，而且通过使用荧光探针和荧光成像来研究表型事件，如缺氧、凋亡或坏死诱导。在Gen5™Microplate Reader和Imager软件中结合z-叠加和投影技术，创建球形细胞的聚焦图像，允许对测试分子或条件的影响进行精确、稳健和可重复的测定。在本应用笔记中，我们展示了BioTek Cytation 5使用PrimeSurface ULA板生成的数据，以开发简单稳健的球形分析，用于亮场和荧光成像。

材料与方法

材料

细胞与培养基

HT-1080纤维肉瘤细胞(目录编号;CCL- 121)从ATCC(马纳萨斯，弗吉尼亚州)购买。高级DMEM(目录号12491- 015)、胎牛血清(目录号10437- 036)和青霉素-链霉素-谷氨酰胺(100X)(目录号10378-016)均购自ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)。

实验组件

已知的拓扑异构酶I抑制剂喜树碱(目录编号208925)购买于EMD Millipore (Billerica, MA)。CellTox绿色细胞毒性试验(目录编号:G8731)从Promega公司(Madison, WI)购买。PrimeSurface 96u底部，透明墙ULA板(目录编号:MS-9096UZ)和primessurface 384 U底部，透明墙ULA板(目录号:MS- 9384UZ)由S-BIO (Hudson, NH)捐赠。

2022世界杯南美区预选赛

Cytation 5是一种模块化的多模式微板阅读器，与自动数字显微镜相结合。基于滤镜和单色仪的微板读数可用，显微镜模块提供高达60倍放大的荧光，亮场，彩色亮场和相位对比。该仪器可以在一个步骤中进行多达四个通道的荧光成像。特别强调活细胞测定，Cytation 5具有震动，温度控制到65℃，CO₂/ O₂气体控制和双喷射器用于动力学分析，并由集成控制Gen5™Microplate Reader and Imager Software，它还可以自动图像捕获，处理和分析。该仪器使用光场和荧光成像技术对primessurface板中的球体进行成像。

方法

三维球体形成

将HT-1080细胞分别以每孔10000、5000、2000、1000、500、250、100和50个细胞浓度添加到96孔和384孔的PrimeSurface U底部微板孔中，体积分别为100或50 μL。微板在37°C/5% CO孵育₂48小时让细胞聚集成球形。

喜树碱处理与死细胞染色

在聚合过程完成后，以1000个细胞/孔的速度播种的球状体的一个亚群被用10000、500、10或0 nM喜树碱处理，通过手动去除培养基，并用等体积的含有药物的新鲜培养基替换。然后在37ºC/5% CO中孵育₂再孵卵24小时，诱导球状细胞坏死。第二天培养基再次从孔中取出，用含有1倍CellTox Green坏死细胞染色剂的培养基替换。在37ºC/5% CO中孵育₂让荧光探针穿透细胞5小时。最后进行培养基交换以去除多余的污渍。

自动成像程序

进行球形成像以评估生成高质量图像和精确细胞分析的能力。使用表1中列出的成像通道捕获亮场和荧光图像。

表1。每个成像通道的细胞成像。

由于椭球体中的细胞存在于z平面的范围内，在Gen5中设置了z叠加成像程序。在自动聚焦之后，在焦平面上方和下方分别捕获多个图像，以确保细胞在适当的z-高度上成像(表2)。

表2。图像Z-Stacking参数。

三维图像处理

捕获之后，使用焦点叠加算法对z-堆栈中的图像进行z投影，以创建只包含最多聚焦信息的最终图像(表3)。

表3。3D z投影标准。

三维投影图像的元胞分析

使用表4中的标准对未经处理的可变大小球体的投影图像进行细胞分析。

表4．球面识别标准。

对处理过的球状体进行额外的细胞分析步骤，以确定喜树碱处理诱导的坏死活性的程度(表5)。

表5所示。球形坏死诱导分析标准。

结果与讨论

形成球体的亮场成像

对z投影图像的可视化分析表明，HT-1080细胞能够在96孔U底板内形成紧密的球形。同样明显的是，由Gen5™Microplate Reader和Imager Software使用的z-叠加和投影方法可以创建精确的、聚焦的球形图像，无论大小(图1)。

图1所示。96井U底亮场球面成像。由(A) 10000形成的球体的4x z投影亮场图像;(B) 5000;(C) 2000;(D) 1000;(E) 500;(F) 250;(G) 100;或(H)每孔50细胞。

从图像中可见的最后一个观测结果是在亮场成像过程中，微板阱底部产生的平坦的甚至是背景信号。使用Gen5中的直线轮廓工具，可以从图像的一边到另一边画一条线，平分球体(图2A)。这将创建一个代表沿直线的CCD像素强度的亮场强度图。从图2B可以看出，当直线穿过球体时，像素的强度有很大的下降，而其他代表背景的像素则相对明亮且强度均匀。

图2。图像背景和目标物体亮场信号。(A) 100单元球体的4倍亮场图像加上绘制的视图线剖面工具线。(B) 1915 μm线的亮场信号图。

图3展示了使用表4中的参数进行面积和直径测量所需的初级掩模的精确放置。使用这两个指标，可以进行体积计算。

图3。测试球体的细胞分析。Gen5自动绘制的对象蒙版周围形成的球体(A) 10000;(B) 1000;(C) 50个细胞。

在96孔和384孔的primessurface板上进行了球面分析。图4说明了球体体积随细胞播种密度变化的精度和线性关系。

图4。图和线性回归的Gen5 96-和384井计算球体体积。

球形内坏死细胞诱导的荧光成像

对处理过的1000个细胞球体进行成像和染色，以确定喜树碱引起的坏死细胞诱导水平。除了GFP通道中的荧光图像外，还捕获了Brightfield图像，以专门查看被CellTox Green探针染色的坏死细胞。然后创建一个覆盖层来可视化每个球体内的细胞坏死(图5A)。

图5一个．喜树碱诱导球形细胞坏死的显像。球体的4倍z投影，叠加亮场和GFP图像，显示24小时10000 nM喜树碱引起的坏死细胞诱导。

图5 b。初步细胞分析以确定坏死细胞的诱导。Gen5自动绘制的初级物体掩膜约1000个细胞的球形，用10000 nM喜树碱处理。

为了量化诱导坏死的水平，我们再次对球形图像进行细胞分析。为了确定捕获图像中活细胞和死细胞所覆盖的区域，使用表5中描述的亮场通道和主掩模标准，在球体周围放置物体掩模(图5B)。

第二步是量化每个测试球体内坏死细胞覆盖的区域。然而，使用透明壁微板进行荧光成像并确定准确结果的一个问题是来自透明壁的自荧光，有助于图像内的高背景。然而，使用Gen5直线轮廓工具确认，当使用清晰的U底部微板时，没有看到这种现象(图6A)。从图像中不含坏死细胞的区域可以看到持续的低背景信号，这使得受影响细胞的信号变化很容易区分(图6B)。

图6。图像背景和目标物体的荧光信号。(A)用10000 nM喜树碱处理的1000细胞球体的4倍GFP图像，加上绘制的视图线剖面工具线。(B) 1037 μm绘制的GFP信号图。

通过利用U型底板的光学特性，可以在受影响的细胞周围放置精确的物体掩模，无论喜树碱浓度是否产生高或低水平的坏死活性(图7)。

图7。处理过的球状体坏死细胞分析。Gen5自动绘制的物体掩膜周围坏死细胞的球状处理(A) 10;(B) 500;或(C) 10000 nM喜树碱。

当坏死细胞面积除以总细胞面积时，一个归一化的受影响细胞百分比覆盖面积被创建，其中考虑了处理过的1000个细胞球体之间的面积差异。然后根据处理所用喜树碱的浓度绘制这些值(图8)。

图7基于GFP信号的物体掩膜放置图像，以及喜树碱诱导的球形细胞坏死图，证实了使用荧光通道和U底微板可以进行精确成像和分析。

结论

S-BIO PrimeSurface U底部96孔和384孔微板可用于在每个测试井中创建适当大小的、可重复的单个球体。cyation™5和Gen5™软件还提供了在多个z平面上捕获高质量图像的能力，适用于球体成像。微板的光学质量和Gen5软件的结合，然后允许使用亮场显微镜或荧光显微镜对球体内的增殖或诱导表型事件进行精确量化。

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