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一种用于细胞信号通路分析的新型细胞ELISA的自动化

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2012年5月16日



作者: Wendy Goodrich和Peter Banks安捷伦科技公司

摘要

监测和量化细胞信号通路对于理解细胞过程和许多疾病状态的行为至关重要。参与这些细胞级联的蛋白激酶发挥多种不同的生物学作用，包括正常生长和发育;它们的异常行为与包括癌症在内的许多虚弱状态有关。一种新的单洗涤步ELISA检测方法已被开发用于检测基于细胞的信号转导事件。除了提供简单性、速度和灵活性之外，该技术还是一种高度敏感的技术，可以在多个工作流级别实现自动化。为了确认全自动检测下的最佳检测性能，我们进行了研究，以证明良好的检测内和检测间的精密度、准确度、S/B和Z′。随后，开发了“一天一孔”的基于细胞的检测方案，允许在ELISAOne微板中直接处理和裂解细胞。然后使用该程序进行药理学评估，使用MCF-7细胞和多种拮抗剂化合物对PI3/AKT/mTOR信号通路进行激动剂/拮抗剂分析。

简介

细胞信号通路中的蛋白质表达、修饰和协同作用是一个广泛而多样的研究领域。一个例子是，研究证明了对细胞信号通路靶点的组合抑制可能是一种比选择性抑制更有效的疾病状态治疗手段的观点。典型的，但不是唯一的，癌症模型使用和多途径靶点和复合抑制剂作为一个面板运行。1、2使用这种范式发现的证据可以相当重要:

“为了确定由PI3激酶激活驱动的癌症的关键靶点，我们筛选了一组有效的、结构多样的靶向该酶家族的类药物分子。令人惊讶的是，尽管许多化合物能够通过下游效应因子Akt阻断PI3激酶信号，但单剂(PI-103)却能抑制胶质瘤细胞的增殖。PI-103独特的细胞活性可直接追溯到其抑制PI3激酶α和mTOR....的能力此外，我们报道的先导抑制剂[PI-103]强调了如何利用PI3激酶催化结构域的保守性来发现具有意想不到效果的多靶点抑制剂。”3.

以前的研究已经说明和描述了选择性细胞信号通路，并证明了基于细胞的信号转导分析的成功自动化。4、5在这里，这些数据是通过自动化的一种新型的基于细胞的ELISA来补充内源性磷蛋白分析。具体到总靶标和磷酸化靶标检测水平，ELISAOne分析格式允许并行量化和归一化数据(图6B)。使用复合面板筛选目标(图6C)，或确定激动剂刺激的最佳诱导浓度(图6A, 6B)都是这里强调的应用。该方法也非常适合于磷酸化蛋白质组学全局分析技术的下游结果验证。

由于只有一个洗涤步骤，检测的简易性和效率可与典型的高通量模型的“混合和读取”格式相媲美。这里显示的自动化是标准的ELISA设备，不需要专门的模块，并且可以以大多数实验室都能获得的成本获得。除了将自动化引入检测工作流程之外，通过开发一种简短的细胞处理协议，可以在典型工作日内使用很少的消耗品快速有效地完成测试的好处得到了增强。

从细胞和检测准备到靶点检测，该工作流程使MCF-7细胞中p-AKT抑制的多个复合剂量反应在一个ELISAOne微板中完成，产生结果的时间不到6小时。

测定原理

MAPK中超过30个目标;一种蛋白激酶;NF-kB p65;统计;和Wnt通路家族可作为elisa分析。ELISAOne以带格式处理了通用涂层，对所有目标的检测过程是相同的，允许在单个微板上自定义配置并行目标检测。该方法使用捕获和检测抗体的单溶液相传递、一个洗涤步骤、一个底物开发步骤和吸收或荧光检测。目标家族之间共享裂解、洗涤和底物溶液增加了检测的整体优势。

TGR Biosciences ELISAOne信号转导检测原理。

图1．TGR Biosciences ELISAOne信号转导分析原理。

材料和方法

材料

  • TGR BioSciences ELISAOne phospho-ERK 1/2 (T202/Y204) 96孔试剂盒，部件号EKT001;phospho - p70S6K (T389) 96孔套件，零件号EKT010;Phospho-AKT 1/2/3 (p - S473) 96孔试剂盒，零件号EKT002;总AKT 1/2/3 96孔套件，零件编号EKT012;ELISAOne微板(零件号EPL001)
  • 5% Gibco胎牛血清Hanks缓冲盐水溶液
  • 生长培养基(DMEM/F12营养混合生命技术公司(零件号11330032);Gibco的边后卫10%;1% Pen/strep, 1% l -谷氨酰胺;它的1%)
  • ATCC(编号HTB-22) MCF-7细胞系取自Sigma
  • 生命科技捷运(部件编号12605028)
  • Tocris Bioscience雷帕霉素(编号1292);沃特曼宁(零件号1232);PI-103盐酸盐(零件号2930);盐酸LY294002(零件号1130)
  • 人重组Sigma-Aldrich胰岛素(部件号91077C)
  • 康宁75和150厘米2斜颈细胞培养烧瓶。

自动化

安捷伦B2022世界杯附加赛决赛ioTek Precision XS自动移液系统用于所有系列稀释和转移到分析板，用于分析方法验证和药理学评估。

2022世界杯附加赛决赛MultiFlo自动分配器蠕动泵盒用于在培养基中播撒细胞到检测板，所有检测试剂分配器使用低流速和安捷伦BioTek液体处理控制(LHC)软件。2022世界杯附加赛决赛安捷伦B2022世界杯附加赛决赛ioTek MultiFlo和ELx50垫圈舒适地并排安装在36英寸层流罩中。卡带是完全可高压灭菌的，增加了MultiFlo的兼容性，以细胞为基础的工作。

使用安2022世界杯附加赛决赛捷伦BioTek ELx50微板条状清洗机通过平板NUNC扁平协议进行检测洗涤步骤。在使用少于12 × 8井条的情况下，采用30秒的浸泡时间。该仪器还进行常规细胞培养工作，包括培养基交换和细胞洗涤(数据未显示)。紧凑的占地面积是有利的，当工作在较小的层流罩。

一个安2022世界杯附加赛决赛捷伦BioTek2022世界杯预选赛 多模读取器用于检测原始荧光单元，使用540/25滤波器组进行激发，590/20滤波器组进行发射。在高孔进行自动灵敏度测试后，所有后续实验均采用46设置。每种仪器和应用的灵敏度应独立确定。

方法

验证的自动化

分别以50%(1:2.5)和10% (1:75)pg/mL浓度的阳性对照裂解液稀释曲线连续4天，每组重复6次，检测p-ERK。绘制每种稀释剂的曲线拟合图，计算每一天(分析内)和多日周期(分析间)的Z′、S/B和精密度数据。所有病例均以试剂盒阴性对照为0标准。Z′用500 pg/mL对照裂解液。S/B使用100 pg/mL对照裂解液，因为它可以与分析证书(COA)进行比较，以验证预期性能。p-p70S6K也使用相同的图谱和工作流程全自动运行，以报告第二个靶点的分析内部精密度和准确性数据。分析图和自动化工作流程分别如图2和图3所示。结果如图5所示(全部)。

内部/内部变化板块图

图2．内部和内部变异板图。2022世界杯附加赛决赛Agilent BioTek Precision XS自动移液系统对对照裂解液进行两次8点连续滴定(橙色1:2.5，绿色1:1.75)，然后以6个重复的方式将50µL/孔转移到检测板上。

国米/内部变化的工作流。

图3。内部和内部可变性工作流。在4天的时间内运行了4个平板，以完全自动化地检验p-ERK试验的内部和内部性能(图5,a- c)。对另一个靶点p-p70S6K进行额外的分析内数据，使用相同的工作流程来比较不同靶点的结果(图5D)。

全自动“一天一孔”细胞为基础的检测工作流程。

图4。全自动的“一天一孔”细胞分析工作流程。该程序用于取代2个隔夜细胞孵育步骤，然后单独进行2小时拮抗剂治疗。细胞收集到信号检测减少到4到6小时完全自动化(取决于抑制和刺激培养时间)。在这个工作流程的最后遵循的ELISAOne检测方案如图3所示，从抗体混合分配步骤开始。

结果与讨论

检测验证、质量评估的自动化

图5。检测验证、质量评估的自动化。检测间和内部数据导致Z '值>= 0.95,S/B值大于公布的COA的32倍5在所有的58个案例中。0.5 <= Z < 1表示检测结果良好6．

验证检测自动化，精度

图5 b。验证检测自动化，精度。两种滴定法所有标准的测定间精密度均计算为<=5% CV。

检测自动化的验证，重复性

图5 (C, D)。检测自动化的验证，重复性。在全自动操作下，进行了2次连续稀释p-ERK 4天。具有代表性的数据显示，500 pg/mL (5C)和100 pg/mL裂解液(5D)滴定之间和内部的高度相关性。板图如图2所示，工作流程如图3所示。

检测自动化的验证，重复性
检测自动化的验证，重复性

检测自动化的验证，重复性

图5 (E, F)。验证检测的自动化和准确性。使用4-P物流拟合(5 E,F)绘制两种p-p70S6滴定法的测定内数据。200、32和2 pg/mL标准在小于4%的CV下，返回的插值浓度分别为198.6、29.6和2.81 pg/mL。所有标准物的插值浓度(nstds = 8, nreps = 6)在1.25滴定法的平均CV %为4.22%，在1.75滴定法的平均CV %为3.9%。标准点与拟合的高度相关性(R2±0.99)，Z' = 0.98, S/B比已发表的COA6高45%，进一步支持了强大的自动化检测性能。

表1．根据4-P拟合数据的回收率和CV %计算，1.25滴定法(选择它是因为它显示了最宽的范围)的代表性精度为3个数量级。

验证检测自动化，准确性

通过p-AKT拮抗剂反应(I + B)开发基于细胞的“一天一孔”检测方案并实现自动化

协议开发旨在设计和验证一种自动细胞播种和处理程序，该程序可以在不到一天的时间内直接在ELISAOne微板中完成，消除了细胞培养转移和血清饥饿步骤之后单独复合处理步骤的通宵培养组合。这是通过将MCF-7细胞在使用生长培养基的标准细胞培养瓶中培养到约70 - 85%的汇合，收集细胞，在5% FBS_HBSS培养基中稀释到所需的细胞数量(1 × 104细胞/孔)，然后将稀释的细胞直接分配到冲洗过的ELISAOne微板孔中。随后，在10 μ M Wortmannin(一种已知的p-AKT抑制剂)存在下，或在没有拮抗剂的情况下进行2小时血清饥饿，以测量激动剂和基底细胞反应。用4种浓度的胰岛素(50、10、1或0 μ M)给细胞后，孵育15分钟，细胞被裂解，然后在同一平板中检测p-AKT。工作流程如图4所示，结果如图6A所示。该细胞治疗方案随后用于所有后续药理学评估。

受体激动剂EC80AKT (I + B)总与磷酸化信号事件的测定和验证

MCF-7细胞以1 × 10的倍率接种于20 μ L 5% FBS中4使用MultiFlo将细胞/孔直接放入ELISAOne微板中，在37℃下孵育2小时。孵育后，在5% FBS中从6µM(0 - 3µM最终)的胰岛素开始进行2x½log滴定，并将20µL的等份三份转移到使用Precision的ELISAOne板的6列(3列为总AKT，其他3列为磷酸化AKT)。板上的两列空着用于检测对照。细胞在37°C用激动剂刺激15分钟。然后使用MultiFlo将试剂盒5x裂解混合物的10µL添加到板中，随后进行10分钟的RT振荡孵育。每个靶点的阳性和阴性试剂盒对照均为四份。用液相靶标特异性偶联物平行测定总AKT和磷酸化AKT。由此产生的胰岛素EC80p-AKT(图6B)用于后续的拮抗剂剂量反应实验。

药理学评价

药理学评价

药理学评价

图6 (A, B, C)。药理学的评估。(A)说明预测的p-AKT信号在激动剂刺激下的关闭(1 × 10)4细胞/孔，n = 5)验证“一天一孔”细胞治疗程序的有效性(工作流程如图4所示)。基于6A数据，EC的最大胰岛素80剂量反应在10 μ M ~ 1 μ M之间计算。(B)说明0 - 3 μ M胰岛素(n = 3)对p-AKT和t-AKT并行运行的½log剂量响应曲线。总AKT水平与预期一样保持不变，而磷酸化AKT的激动剂刺激会产生EC800.181。(C)显示7.7 × 10的结果3.MCF-7细胞/用多种化合物1:5滴定处理2小时，用EC刺激80从图6B数据中确定激动剂，然后检测p-AKT。所有的集成电路50数值完全在预期范围内。8 9 10

p-AKT多拮抗剂对IC的剂量反应50药理学评估

PI3K/AKT/mTOR通路的4个靶向特异性化合物，雷帕霉素(0 ~ 200 nM)，渥曼肽(0 ~ 10 μ M)， PI-103.(0 ~ 10 μ M)和LY294002 (0 ~ 100 μ M)，分别在100% DMSO中按1:5稀释至37.5倍，然后在5% FBS_HBSS中按1.5倍稀释至4% DMSO中。两个柱不处理胰岛素和细胞控制井。在这些重复中，一半添加4%的DMSO，另一半不添加。将20 μ L的1.5倍复合滴定液(4% DMSO)分配到elisa平板上。使用安捷伦BioTe2022世界杯附加赛决赛k MultiFlo, MCF-7细胞的10µL等分倍数为7.7 × 103.然后分配到板，得到30 μ L的1x化合物在2.66% DMSO最终。37℃孵育2小时后，10 μ L/孔的4x EC80使用MultiFlo分配胰岛素。细胞在37°C用激动剂刺激15分钟。加入10 μ L/孔的5x裂解混合液，在RT条件下摇10分钟。每孔取50µL的对照试剂盒，重复四次，检测培养皿中p-AKT的含量。结果支持p-AKT对雷帕霉素抑制的低敏感性(数据未显示)，以及其余化合物对胰岛素刺激p-AKT的有效抑制(图6C)。

结论

这里强调的仪器性能，加上ELISAOne分析套件提供的多通路家族的大量靶点，为信号转导分析增加了显著的价值。这种合作可以被证明在研究中特别有用，需要测量单个或多个激酶靶点的总水平和磷酸化水平，使用相同的分析技术，以可定制配置的一组化合物进行分析。

全自动的内部和内部检测结果显示低变异性和超过3个数量级的适当回收率，这表明即使在低pg/ mL浓度范围内，精密度和准确性也不会被牺牲。对于多个目标，较高的Z′和S/B值可以巩固性能的信心。从IC的相关性来看，药理学数据也支持自动化下的可靠分析性能50多个化合物的值达到预期范围。

数据支持在细胞制备和检测目标绑定和检测水平上的多个工作流任务的可重复性能，突出了组件仪器的多功能性。自动化可以舒适地并排放置在标准层流罩内，易于清洁和消毒，增加了自动化细胞工作的好处。

参考文献

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  2. http://cancerres.aacrjournals.org/content/69/3/1027。完整的
  3. Cancer Cell 9, 341-349, 2006年5月©2006爱思唯尔公司DOI 10.1016 / j.ccr.2006.03.029
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  8. https://www.tocris.com/乐鱼平台入口products/wortmannin_1232
  9. https://www.tocris.com/乐鱼平台入口products/pi - 103 hydrochloride_2930
  10. https://www.tocris.com/乐鱼平台入口products/ly-294002-hydrochloride_1130

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