使用安捷伦BioTek 405 TS微洗板机实现ELISpot检测的清洗步骤自动化2022世界杯附加赛决赛

作者:Paul Held，博士，安捷伦科技公司

摘要

酶联免疫斑点(ELISpot)检测是一种灵活和强大的工具，用于研究整个细胞的分泌分子，特别是用于分析外周血和淋巴白细胞的免疫功能和反应。ELISpot检测可以提供其他技术不能提供的关于分泌分子的信息。而ELISpot分析可以使用安捷伦BioTek自动化2022世界杯附加赛决赛2022年世界杯抽签 细胞成像多模式阅读器，检测中固有的洗涤步骤通常是手动完成的。这里描述的是一个方便和有效的方法，自动化最繁琐的方面进行ELISpot检测使用多功能安捷伦BioTek2022世界杯附加赛决赛TS 405洗板机。

简介

酶联免疫斑点(ELISpot)检测是一种灵活和强大的工具，用于研究整个细胞的分泌分子，特别是用于分析外周血和淋巴白细胞的免疫功能和反应。ELISpot检测可以提供其他技术不能提供的关于分泌分子的信息。单核细胞是免疫反应的关键调节器，是分泌细胞的一个很好的例子这些细胞作为入侵微生物的清除者和免疫调节细胞因子的分泌者。有许多不同的方法可以测量细胞因子，每一种都有优点和缺点。酶联免疫吸附测定法(ELISA)主要用于测定血清或血浆等体液中的细胞因子。虽然ELISA可以测量分泌的细胞因子，结合蛋白，快速的翻转，检测的困难会限制其有效性。原位-杂交和逆转录- pcr检测细胞因子mRNA的表达，这可能反映或不反映真正的细胞因子蛋白水平。流式细胞术可以提供合成细胞因子的信息，但可能不能提供真实分泌的信息，并且在处理由非常低百分比的细胞表达的分子时存在困难。ELISpot分析允许从混合群体中识别积极分泌的细胞。据报道，ELISpot可以检测出100万个分泌细胞中的一个。²

ELISpot的检测过程与传统的ELISA非常相似。首先在板/膜上涂上适当浓度的捕获抗体，并让其吸收。将未结合的抗体吸出并清洗培养皿。然后每个孔填充阻塞溶液，并允许在室温下孵育2小时。需要注意的是，可以使用由制造商提供的预先涂有捕获抗体以及阻止非特异性蛋白结合的ELISpot板特异性试剂盒。将培养的分泌细胞与实验用有丝分裂原或感兴趣的抗原一起加入孔中。细胞保存时间为24至48小时，之后通过清洗去除细胞。分析物仍然与捕获的抗体结合在细胞膜上分泌分析物的细胞所在的位置附近。

图1．ELISpot检测程序。

去除细胞和任何未结合的物质后，将生物素化检测抗体添加到孔中，并允许孵育。通过清洗去除多余的检测抗体，添加链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物。再次，通过洗涤除去未结合的共轭物，然后添加酶共轭物的特定底物，并允许颜色发展。然后手工或使用自动分析仪分析/计数产生的斑点(图1)。

ELISpot检测技术是从夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)中衍生出来的，以适应整个细胞的使用，并提供一种方法来识别分泌细胞的位置和频率。这通常是通过使用聚偏二氟乙烯(PVDF)膜而不是固体聚苯乙烯基板来固定捕获的抗体来实现的。然后，可以使用Cytation 7细胞成像多模式阅读器对合成的彩色斑点进行自动分析。^3.虽然生成斑点的分析是自动化的，但检测中固有的清洗步骤通常是手动完成的。

在本研究中，采用elisa法监测外周血单个核细胞(PBMCs)分泌的干扰素-γ (IFN-γ)，以评估405 TS洗衣机的性能。IFN-γ是一种14 ~ 18kd, 143个氨基酸的糖基化蛋白，是一种强大的多功能细胞因子。它是一种II型或免疫干扰素，主要由T (CD8+)细胞和NK细胞分泌。有丝分裂原植物血凝素(PHA)可刺激T细胞分泌IFN-γ。因此，将手工洗涤程序和使用405 TS全自动96孔洗衣机的ELISpot的结果进行比较，将是演示自动化方法效用的理想方式。这里描述的是使用405 TS洗衣机来执行检测程序所需的洗涤步骤。

405 TS是一种多功能微板清洗机，可以清洗96孔和384孔微板，不需要任何机械变化。分配器和吸气管汇被放置在两个物理上不同的部分，被安排在彼此的顶部。下部管汇(分配器)的构造方式使来自上述管汇(吸入管)的管通过并进入微板的孔。为了使分配管能够将液体分配到小井中，同时吸气管正在从同一口井中取出液体，就像进行溢流和洗底时的情况一样，分配管从垂直倾斜。这使得分配管从井的中心偏移，为吸入管提供了空间，但仍然允许流体射流从井的一侧进入井内。这种倾斜的设计还有一个额外的好处，即提供了流体的旋转运动，从而使清洗更加有力。405 TS洗衣机可以直接从洗衣机上的键盘编程，具有完整的功能。含有多达75种不同分析的分析文库可以存储在洗衣机上。连接不同的洗涤、启动和分发协议的能力实际上允许无穷无尽的洗涤协议。

材料与方法

96孔多网过滤板(零件号MSIPS4W10)购自Millipore。无钙和镁PBS(10倍浓缩)来自Invitrogen-BRL。捕获(部分编号3420-3)和生物素偶联(部分编号3420- 6)小鼠抗人IFN-γ单克隆抗体购自Mabtech (Mariemont, OH)。之前将外周血单个核细胞(pmcs)分离并冷冻(-80°C)保存，直到需要。

首先用70%乙醇(100 μ L/孔)湿润多筛96孔过滤板10分钟，以克服膜的疏水性。然后用冷PBS(不含钙和镁)冲洗几次，以确保所有残留的乙醇都被清除。去除PBS后，在每个孔中加入80µL小鼠抗人IFN-γ捕获抗体，该抗体之前已被PBS稀释到1µg/80µL或0.5µg/80µL的浓度。每种抗体浓度都加入到培养皿的一半。然后将平板覆盖，并在5°C的潮湿环境中孵育一夜。第二天，去除未结合的捕获抗体，PBS洗1次(100 μ L/孔)。洗净后，加入200µL/孔的封闭液(10%胎牛血清PBS)， 37°C孵育4小时。去除阻塞溶液，将不同数量的pbmc(25,000、50,000、100,000和200,000个细胞/孔)以50 L的体积移至孔中。此外，4个阴性对照孔未接收任何细胞。加入细胞后，每半板分别加入50µL的RPMI培养基或含有20µg/mL植物血凝素(1µg/孔)的RPMI培养基。 The plates were then placed in a CO₂在37°C潮湿条件下培养过夜。第二天早上，用PBSTween 20(0.5%)手动或405 TS清洗机(每个循环含300µL缓冲液)洗涤6次。洗衣机参数设置见表1。注意，盘子在洗盘子机中按一个方向洗三次，然后把盘子旋转180度，再洗三次。然后加入二抗(生物素结合单克隆小鼠抗人IFN-γ)。二抗之前已经在pbs -吐温(0.5%)BSA(1%)中稀释，这样一半孔接受0.5µg/孔，另一半孔接受(0.25µg/孔)80µL的容积。然后在37°C潮湿条件下孵育2小时。孵育后，用0.5%的pbs -吐温手动或用405 TS洗涤三次(300µL /循环)，然后加入80µL的链霉亲和素碱性磷酸酶共轭物，该共轭物之前已用pbs -吐温0.5%稀释1:10 00。加入共轭物后，再次在室温下孵育2小时。再次洗涤(手动和自动)三次去除未结合的共轭物，每循环300 μ L pbs -吐温0.5%和100 μ L NBT/BCIP(皮尔斯化学)加入并显示颜色。 Color development was performed at ambient temperature in the dark for 30 minutes, after which the reaction stopped by rinsing with deionized water. Plates were then dried and analyzed. See Table 1 for washer parameter settings.

表1。洗衣机参数设置。

结果与讨论

图2A和图2B分别描述了使用ELISpot和自动和手动洗涤程序获得的典型结果。在这两种情况下，通过ELISpot斑点计数测量，未受刺激的细胞显示出非常少的INF-γ分泌，无论最初被镀的细胞数量如何。由于细胞数量较少，在未受刺激的细胞中几乎没有观察到斑点，而PHA刺激细胞时，观察到的斑点相当多(图3)。无论板是手工清洗还是使用Agilent BioTek 405 TS微洗板，这都是一致的。2022世界杯附加赛决赛在用PHA刺激细胞的实验中，通过观察到的斑点测量，INF-γ的分泌是明显的。计数斑点的数量与最初镀上的细胞数量成正比，表明这些斑点不是糟糕的洗涤技术(手动或自动)的结果。此外，405个TS洗井的计数斑点数量与手动洗板时返回的斑点数量几乎相同(图4)。不管条件如何，自动洗程序的结果与手动洗观察到的结果非常相似。

在这些实验中，在受控环境下检测糖蛋白IFN-γ的刺激分泌，以评估安捷伦BioTek 405 TS微洗板执行96孔膜ELISpot检测板的清洗任务的能力。2022世界杯附加赛决赛这些数据表明405 TS微洗板机是一个可行的替代手工清洗ELISpot板。为了获得最佳的ELISpot性能，需要调整许多参数。这些指标包括一抗和二抗浓度、孵育时间和温度、洗涤缓冲液成分以及显色时间。一旦这些参数得到优化，就需要一致的洗涤以获得可重复的结果。在这些实验中，人工和自动清洗程序都采用了相同的结果。在ELISpot检测中，膜而不是塑料的主要用途是其能够显著保留更多捕获抗体的能力，这反过来会导致更好的斑点染色。不幸的是，细胞膜对抗体的粘附特性也导致细胞和其他碎片的粘附，使它们难以清除。残留的粘附细胞可能被非特异性染色，导致覆盖整个表面的背景，或被染成像斑点一样，有可能与特定斑点混淆。正确有效的清洗是必须的。²

图2。代表性ELISpot井采用自动和手动清洗程序进行ELISpot清洗步骤。用(a)安捷伦BioTek 405 TS微洗板或(B)手动洗板产生的图像和斑点计数。2022世界杯附加赛决赛每张图像的上面三孔描绘的是未受刺激的细胞，而下面三孔描绘的是PHA刺激的细胞。

图3。受刺激与未受刺激pbmc的比较。使用elisa法比较未被PHA刺激或被PHA刺激的pbmc。用手工或安捷伦BioTek 405 TS微洗板机进行洗板。2022世界杯附加赛决赛

图4。模拟pbmc中手动和自动洗板的比较。用PHA刺激不同数量的PBMCs，并使用手动方法或Agilent BioTek 405 TS 96孔微洗板机洗涤，生成ELISpot数据。2022世界杯附加赛决赛绘制数据并进行二次多项式线性回归分析。

结论

使用安捷伦BioTek2022世界杯附加赛决赛 405 TS微洗板允许自动化的一个比较繁琐的ELISpot检测任务。与任何自动化设备一样，405 TS洗衣机提供了一致的洗涤技术，无论一天中的时间或处理的盘子数量，而手动洗涤方法容易在用户内部和内部变化。配置405 TS的关键是确保吸入管不接触板膜的表面。虽然触摸膜有可能刺穿膜，但通常的结果是在颜色显现时产生人工信号。这些斑点使得正确的分析更加困难，如果不是不可能的话。

确认

我们非常感谢Ramu A. Subbramanian博士、Kristen Emerson、Michele Neace和Mohamed T. Shata博士。所有这些实验都在辛辛那提儿童医院医学中心，儿科，传染病科(辛辛那提，俄亥俄州)进行。苏布拉曼尼亚博士在他的实验室里安排和协调了这些实验。Kristen Emerson和Michele Neace进行了ELISpot实验，包括平板制备，细胞电镀，以及手动清洗程序。Shata博士还提供了ELISpot分析的实验和技术建议。

参考文献

1. Kouwenhoven, M.， V. Özenci, N. Teleshova, Y. Hussein, Y. Huang, a . Eusebio，和H. Link(2001)酶联免疫点测定为检测单核细胞分泌的细胞因子提供了一种敏感的工具。临床与诊断实验室免疫学8(6):1248-1257。
2. ELISPOT手册。方法和协议，(2005)Alexander E. Kalyuzhny Ed. Humana Press, Totowa, NJ。
3. Held, P.(2020)使用Cytation 7细胞成像微板阅读器对人外周血单个核细胞进行成像和分析ELISpot检测。