使用InCELL平台对甲基转移酶和溴化结构域蛋白进行直接的、基于细胞的、目标化合物相互作用的自动化分析

作者:安捷伦科技公司Brad Larson和Peter Banks;苏尼塔·戈帕兰，玛尼莎·普拉塔普，达纳·海莉-维森特，欧陆坊DiscoverX

简介

组蛋白修饰在真核基因表达和调控中至关重要，由组蛋白书写蛋白、擦除蛋白和解读蛋白驱动。这些组蛋白尾巴的变化是动态的，是细胞从最初的全能状态分化的正常部分。然而，异常的组蛋白修饰与许多疾病状态有关¹，包括许多人类癌症。例如，含有G9a甲基转移酶书写蛋白的赖氨酸特异性SET结构域在各种癌症中都过表达。它还缺乏CD4+ T辅助性细胞，导致肠道感染率增加。²在另一个例子中，BET溴化域解读蛋白Brd4通过与NUT的融合参与了NUT中线癌(NMC)。^3.由于这些和其他的发现，甲基转移酶和溴化域蛋白是许多药物发现项目的目标。

目前的生化分析技术检测甲基转移酶和溴化域蛋白抑制的酶活性。这些分析缺乏监测复合靶点在细胞环境中的参与，这是验证候选药物药理学的必要条件。此外，基于细胞的分析表观遗传蛋白抑制剂的方法以前仅限于使用抗体检测特定的组蛋白修饰。当没有抗体时，需要另一种方法。因此，需要一种健壮的、高通量的细胞为基础的检测方法，可以在不依赖抗体的情况下识别与蛋白质催化结构域结合的化合物。本研究描述了无抗体、基于细胞的检测平台InCELL Hunter，该平台能够检测G9a甲基转移酶和多个溴化域蛋白的潜在小分子抑制剂的特异性结合和直接蛋白结合。

作为本研究的补充，了解如何使用该平台开发基于细胞的高通量分析，用于额外的Brd4抑制剂和精氨酸甲基转移酶3 (PRMT3)抑制剂，详见补充数据部分。

基于Hunter细胞的检测原理

来自Eurofins DiscoverX (Fremont, CA)的InCELL Hunter分析是一种靶向特异性分析，通过检测蛋白质稳定性的变化来研究细胞中复合靶点的结合(图1)。这种蛋白质稳定性的变化是通过利用工业验证的酶片段互补(EFC, discoverx.com/efc)技术带来的化学发光信号来测量的。该技术提供了一种定量的、均匀的检测格式，快速、健壮、可扩展，无需使用抗体、质谱或成像。目标蛋白与小的非活性β-半乳糖苷酶(β-gal)酶片段ProLabel (ePL)融合，并在选定的细胞背景中表达。在缺乏结合化合物的情况下，目标- epl融合达到稳定状态，只有当化合物与目标结合时才会增加。添加互补的较大的β-gal片段酶受体(EA)，促进ePL和EA的互补，产生活性β-gal酶。添加的底物被β-gal酶水解产生化学发光信号，这表明epl标记蛋白的稳定性发生了改变。InCELL Hunter测定法对具有相对高周转率的蛋白质特别有用，已成功地用于确定复合细胞的渗透性和效力。

图1所示。基于Eurofins DiscoverX EFC技术的InCELL Hunter检测原理。这些测定中的细胞内靶蛋白与β-gal酶的小酶供体片段ePL融合。一旦添加了结合靶标的化合物，细胞中的蛋白质水平就会稳定或改变，这种变化可以通过使用化学发光检测来测量靶蛋白的丰度来监测。检测试剂包括一种化学发光底物，其中添加了一个大的酶受体(EA)片段，该片段与目标蛋白上的ePL标签自然互补，从而产生一个活性β-gal酶。产生的活性酶水解底物产生化学发光信号。信号越大，对应细胞中复合目标交战的存在越大。

材料与方法

材料

分析组件

InCELL Hunter eXpress Brd2(1) Bromodomain assay (part number 96-0004E1CP0S)， InCELL Hunter eXpress Brd4(1) Bromodomain assay (part number 96-0005E1CP0S)，和InCELL Hunter eXpress G9a Methyltransferase assay (part number 96-0003E15CP7S)试剂盒，包含表达适当表观遗传靶蛋白的准备好的InCELL Hunter细胞，细胞电镀(CP)试剂和检测试剂，均使用Eurofins DiscoverX (Fremont, CA)。Bromodomain法纳入InCELL Hunter HEK 293 Brd2(1)和HEK 293 Brd4(1)细胞，G9a甲基转移酶法纳入InCELL Hunter A549 G9a细胞。

化合物

43个化合物筛孔表观遗传学库1.0版本(部分编号为BML-2836-0500)由Enzo生命科学公司(普利茅斯会议，PA)慷慨捐赠。已知的溴域抑制剂(+)-JQ1(部件号92-1149)来自Eurofins DiscoverX (Fremont, CA)。sinfungin(零件号S8559)和2,4-吡啶二羧酸(2,4- pdca)一水(零件号P63395)购自Sigma-Aldrich公司(圣路易斯，密苏里州)。UNC 0646(零件号4342)和UNC 0638(零件号4343)从研发系统公司(Minneapolis, MN)购买。

仪表

安捷伦B2022世界杯附加赛决赛ioTek精密微板移液系统在一台仪器中结合了一个8通道移液头和一个8通道散装试剂分配器。使用Precision稀释表观遗传学文库，并将最终的5倍浓度转移到384孔的分析板上。

微型板块分发器

安捷伦B2022世界杯附加赛决赛ioTek MultiFlo微板分配器通过其两个蠕动泵和两个注射泵提供了快速、准确的平板分配器功能，容积从0.5到3000 μL。MultiFlo用于分配包括细胞在内的所有检测组分，并以384孔格式制备检测试剂。

多模微刻版阅读器

安捷伦B2022世界杯附加赛决赛ioTek Synergy Neo HTS多模微板阅读器具有专利混合技术，将基于过滤器的检测系统和基于单色仪的检测系统结合在一个单元中。专用的高性能发光检测系统用于量化来自每个分析井的发光信号，集成时间为0.2秒，增益为120。

方法

使用高通量液体处理和检测仪器在384孔格式中进行自动化分析程序。初步实验包括细胞数优化和复合孵育时间优化。这样做是为了最大化含有复合靶细胞的井和只有靶细胞的井之间的信号对背景的转换，同时还有一个Z'-因子⁴验证。一个小的，集中的库的表观遗传抑制剂小分子化合物，然后筛选与每个目标分析。最后，使用化合物筛选和已知抑制剂阳性对照化合物的命中完成剂量反应试验。实验结果证实，自动化细胞检测技术能够准确检测检测化合物的靶特异性相互作用，假阳性率低，对这些重要的表观遗传靶标以简单而可靠的方式进行检测。

细胞的准备

取500 μL适当的CP试剂，以12 × 10的浓度加入到100 μL的已测定的InCELL Hunter细胞中⁶细胞/mL制600 μL 2.0 × 10⁶细胞/毫升。通过将细胞转移到额外的CP试剂中，每次实验将细胞进一步稀释到适当的浓度。

细胞浓度和反应时间优化

将InCELL Hunter HEK 293 Brd2(1)细胞以16000至0个细胞/孔的浓度镀至两个独立的384孔微板上。在37°C和5% CO下培养₂24小时或48小时。孵育后，在每个细胞浓度的一半孔中加入10 μM (+)-JQ1溴化域抑制剂(1x)，另一半孔中加入镀液。在37°C和5% CO下培养₂6个小时。每孔加入检测试剂，室温孵育30分钟。然后使用Synergy Neo和前面提到的发光设置量化发光信号。

自动化InCELL Hunter化验工作流程

取20 μL的InCELL Hunter细胞，浓度为5 × 10⁴将细胞/mL镀至384孔板的每个微孔中，然后在37°C和5% CO中培养₂48小时。孵育后，在每孔中加入5 μL滴定化合物，在37℃和5% CO中孵育₂六个小时。每孔取30 μL检测试剂，室温最后孵育30分钟。然后使用Synergy Neo和前面提到的发光设置量化发光信号。

自动分析Z′因子验证

在Z′因子实验中，采用Brd2(1)和Brd4(1)细胞和浓度为10 μM和0 μM的溴化域抑制剂(+)-JQ1作为阳性和阴性对照，以测定测定的鲁棒性。采用G9a细胞和浓度为10 μM和0 μM的甲基转移酶抑制剂UNC 0638作为阳性和阴性对照，运行自动化的检测流程。每种化合物浓度48个重复用于每次试验。并在初始实验中优化了细胞浓度和后镀时间。

复合库屏幕

48种化合物，包括43种化合物Screen-Well表观遗传文库，抑制剂sinfungin, 2,4 PDCA， (+)-JQ1, UNC 0646和UNC 0638，分别在适当的CP试剂中从最初的10 mM浓度稀释到最终的1倍浓度20 μM, 2 μM和200 nM。按照上述自动化工作流程，使用Brd2(1)、Brd4(1)和G9a测定每种化合物浓度。通过对化合物库屏幕上的每个命中化合物以100 μM 1倍浓度开始的连续1:4滴定，进行剂量反应试验。根据上述自动化工作流程，使用Brd2(1)、Brd4(1)和G9a测试每种命中化合物。

计算

优化每孔细胞浓度和镀液后孵育时间的反应时间对于最大化含有复合结合靶细胞和非结合靶细胞的孔间的信噪比(S/B)至关重要。绘制含有10 μM或0 μM (+)-JQ1的孔的相对发光单位(RLU)，这些孔来自细胞孵育24小时(图2A)或48小时(图2B)后镀。S/B值计算如下:

然后绘制所有细胞浓度(图2C)和仅250 ~ 2000个细胞/孔的计算S/B值(图2D)。从图2D中可以看出，在含10 μM或0 μM抑制剂的井中，在24小时和48小时的电镀次数达到2000个细胞/井时，计算得到的S/B保持稳定并略有增加。

结果与讨论

当比较在相同细胞浓度下孵育24小时或48小时的细胞的结果时，48小时孵育细胞的S/B数据发现始终高于24小时孵育细胞的S/B值大于20。因此，选择1000个细胞/孔的细胞浓度和48小时的镀膜后培养时间用于后续的实验和跨细胞株，以确保高S/B比，同时最小化细胞使用率。

图2．细胞浓度和电镀后孵育结果。RLU值绘制于含有10 μM或0 μM (+)-JQ1的孔中，细胞在电镀后24小时(A)或48小时(B)孵育。计算所有测试细胞浓度的S/B值(C)以及仅250-2000个细胞/孔(D)。

自动分析Z′因子验证

Z′因子值考虑了阳性对照和阴性对照之间的信号差异，以及重复之间的信号变化。采用了从0到1的分级，数值大于或等于0.5，表明该分析非常优秀。用三种自动分析方法(图3)生成的Z'-因子值分别为0.82 (Brd2(1))， 0.79 (Brd4(1))和0.80 (G9a)，每一种方法都表明了一种优秀的、可靠的分析方法。

图3。自动检测z因子验证。自动(A) Brd2(1)， (B) Brd4(1)和(C) G9a测定的Z '因子结果。

复合库屏幕

筛选- well表观遗传学库和五种已知的抑制剂使用已验证的自动Brd2(1)， Brd4(1)和G9a分析来寻找潜在的目标蛋白抑制剂。通过比较含有孔的化合物的发光信号与不含孔的化合物的发光信号，确定三种化合物浓度的每种测定化学物质的折叠诱导(数据未显示)。2倍诱导值表示RLU值比不含化合物的井的平均值增加了2倍。
发光增加表明化合物与目标蛋白- epl融合结合，分子稳态增加。发光的程度也可以表明化合物抑制目标蛋白质活性的潜力。在某些化合物(包括BIX-01294、UNC 0646和UNC 0638)筛选的最高浓度下，折叠诱导率下降。这种下降可能是由于化合物对用于特定试验的细胞系的细胞毒性作用。化合物产生超过2倍的发光信号增加进一步测试，以辨别其充分的抑制潜力。有关筛选- well表观遗传学文库和筛选结果，请联系DRX_SupportUS@eurofinsUS.com。

这些化合物在化合物筛选中显示出超过2倍的发光信号增加，使用经过验证的自动Brd2(1)， Brd4(1)和G9a分析进行剂量反应分析，以检查目标选择性。对剂量-反应试验中包含的所有化合物的折叠诱导值进行绘制，每次测定。如果化合物浓度高，细胞毒性作用明显，则排除在考虑范围之外。

根据图4，已知的溴化域抑制剂(+)-JQ1和G9a甲基转移酶抑制剂UNC 0646和UNC 0638均显示出预期的抑制谱和EC₅₀值^5、6、7，从而验证筛选和剂量反应试验结果。图4还显示，随着浓度的增加，BIX-01294化合物也表现出与G9a的结合亲和力。这一现象在G9a分析中是选择性的，文献也证实了BIX-01294与蛋白的底物肽槽结合。⁸BIX-01294与两个溴化结构域蛋白没有明显的结合。

图4．复合文库筛选剂量-反应分析。剂量响应试验结果，显示感应曲线和EC₅₀用(A) Brd2(1)， (B) Brd4(1)和(C) G9a测定已知抑制化合物的值。虚线表示折痕诱导值为1，以供参考。

结论

InCELL Hunter表观遗传G9a甲基转移酶、Brd2(1)和Brd4(1)测定提供了一种准确、简单、基于细胞的一体化形式，以评估化合物与特定目标的结合。使用安捷伦BioTek精密微板移液系统和安捷伦BioTek MultiFlo微板分配器，检测过程很容易自动化，用于384孔格式的高通量分析。2022世界杯附加赛决赛此外，安捷伦BioTek Syner2022世界杯附加赛决赛gy Neo高性能发光检测提供了敏感的化学发光信号检测，允许使用细胞浓度低至1000个细胞每井。

筛选数据显示，只有当化合物与特定的细胞内靶蛋白相互作用时，发光信号才会增加，产生低的假阳性率。最后，结合检测化学、液体处理和检测微板仪器，为这些重要表观遗传靶点的抑制化合物鉴定创造了一个简单、健壮和确定的细胞为基础的解决方案。

补充数据

基于细胞的蛋白质稳定分析，用于检测小分子抑制剂和BRD4之间的相互作用

溴化结构域蛋白4 (BRD4)是一种转录和表观遗传调控因子，已知在几种癌症中驱动致癌基因的表达。BRD4通过两个溴化结构域BD1和BD2与乙酰化的组蛋白尾结合。

通过小分子抑制剂抑制brd4 -组蛋白结合被发现是一种有用的未来癌症治疗方法。本文描述了两种正交试验，包括基于InCELL Hunter平台的小型化试验，用于评估小分子抑制剂对BRD4的稳定性。¹¹

蛋白质精氨酸甲基转移酶3 (PRMT3)的一种有效的、选择性的、细胞活性的变构抑制剂
PRMT3催化精氨酸残基的单甲基化和不对称去甲基化。这种酶与几种疾病有关，如眼咽肌营养不良症、冠心病和肿瘤生长。本文介绍了PRMT3的第一个变构抑制剂SGC707及其与PRMT3在InCELL Hunter平台上的结合。¹²

脉冲目标交战分析

InCELL脉冲分析格式允许简单和快速的测量复合靶的结合，特别是热不稳定的蛋白质。InCELL Hunter和InCELL Pulse格式类型共享相同的基本EFC原则，但有一些关键的差异，以适合不同的目标。了解更多关于InCELL平台的信息，并访问可用的细胞系和试剂盒discoverx.com/InCELL．

确认

作者要感谢恩佐生命科学公司慷慨捐赠Screen-Well表观遗传学图书馆。

参考文献

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仅供研究用途。不用于诊断程序