Luminex xMAP®Assays自动化工作流程

作者:Paul Held和Peter Banks, BioTek仪器公司，威诺斯基，佛蒙特州

摘要

基于珠的多路复用分析，如由Luminex xMAP®技术提供的分析，已被证明对细胞、组织和体液的生物标志物识别和定量非常有用。应用领域包括生物学研究、药物发现和临床诊断。基于使用聚苯乙烯微球的原始技术往往具有繁重的手工工作流程，容易产生累积的系统和随机误差，从而导致量化精度问题。在这里，我们通过使用BioTek聚苯乙烯和磁性微球的微板垫圈来证明精度和易用性的改进。从半满的微孔板到满的96井和384井微孔板，可以实现工作流程的自动化。

简介

从业人员使用生物标志物来检测疾病和改善治疗是一种古老的做法。脉搏和血压测量是大多数身体检查的一般方法——这些是具有悠久历史的一般健康的生物标志物。今天，生物标记物通常是分子性质的。通常可以通过使用多种生物标志物来改善与疾病或药物效果的相关性。Luminex xMAP技术是同时测量多种生物标志物最常用的多路复用技术之一。目前Luminex有37家合作伙伴生产基于xMAP技术的试剂系统，用于研究、药物发现和临床诊断应用。

原来的xMAP技术是基于聚苯乙烯微球的使用。基于微板的样品制备涉及使用真空过滤去除样品基质和多余的试剂，其方式类似于基于细胞膜的配体受体结合实验。虽然可以达到可接受的分析性能，但该过程容易出现个别堵塞井，难以完全自动化。磁性微球最近已经出现，极大地提高了易用性，并使xMAP技术更易于自动化。在本应用笔记中，我们将演示BioTek一系列用于xMAP分析自动化的微板清洗机的性能属性:从聚苯乙烯微球的带式清洗机到使用磁性微球的全微板清洗。

BioTek Microplate washer

BioTek适用于xMAP分析的微孔板清洗机产品线包括ELx50™带式清洗机，ELx405™全微孔板清洗机和EL406™组合清洗机。全板清洗机可与BioTek的双作用歧管™，提供分配和抽吸歧管的独立控制，以实现高效的珠洗和低残留量。该产品还乐鱼平台入口使用角度分配管，完全控制分配和抽吸率和独特的X, Y, Z定位，以确保良好的珠回收，无论微孔板密度或结构。每个产品都配备了聚苯乙烯珠真空过滤能力的模型;或配以高磁场强度磁体的型号适合磁珠。ELx50洗条机适用于低吞吐量操作;ELx405更适合于高通量应用，EL406结合了ELx405的冲洗能力和蠕动泵和/或注射泵为基础的试剂添加。

图1．BioTek适用于Luminex xMAP测定的清洗机产品系乐鱼平台入口列:左:适用于聚苯乙烯微球的具有真空过滤能力的ELx50型号(磁性微球型号也可);中心:ELx405型采用高场强磁体，适用于磁性微球(真空过滤型号也可);右:EL406型高场强磁铁磁性微球和试剂分配应用(真空过滤模型也可用)。

定量分析的典型自动化工作流程

蛋白质生物标记物

xMAP®蛋白质生物标志物样品的工作流程基本上与聚苯乙烯或磁性微球相同。通常工作流程使用传统的基于elisa的策略，使用一抗固定分析物到载体(即微球)，然后将二抗标记抗体添加到蛋白质上的不同表位，最后以检测试剂结束，该试剂将与二抗上的标签结合。如果使用复杂的样品基质，则需要在样品引入后(以减少背景信号)或在最后加入检测试剂以简化工作流程后进行清洗。工作流程如下图2所示。

图2．蛋白质生物标志物定量的典型工作流程。红色字体表示使用BioTek清洗机自动化清洗过程。SAPE是指链霉亲和素偶联藻红菊酯作为检测试剂。

基因表达生物标志物

基因表达生物标记物量化通常受益于扩增过程。这可以采取一种形式，首先使用逆转录酶将mRNA转化为DNA，然后使用传统的聚合酶链反应(PCR)技术扩增产物，或者使用支链DNA技术扩增mRNA的结合试剂。这是Panomics(现为Affymetrix)商业化的QuantiGene技术的基础，如下图3所示:

图3。基因表达生物标志物定量的典型工作流程。红色字体表示使用BioTek清洗机自动化清洗过程。SAPE是指链霉亲和素偶联藻红菊酯作为检测试剂。

从工作流程的比较中可以明显看出，相对于蛋白质生物标记物，基因表达生物标记物量化的自动化更复杂，更容易从样本处理中涉及的多个步骤中产生更多随机错误。

方法

使用ELx50™提供的聚苯乙烯微球和真空过滤，以及使用ELx405™提供的高场强磁铁的磁性微球进行蛋白质生物标志物定量分析。基因表达生物标志物定量使用磁性微球和上述相同的ELx405模型进行。仪器设置和材料的完整说明可在其他地方获得2-4。

结果与讨论

蛋白质生物标志物- ELx50™真空过滤

自动化的真空过滤服务提供更大的“易用性”比手动使用单独的真空歧管和处理排样品和完整的微板更快。如图4所示，使用标准量的TSH进行单plex促甲状腺激素(TSH) xMAP®检测。在24个孔中重复测量每个标准，并使用Luminex 200系统测量中位荧光强度(MFI)。使用ELx50的自动化工作流程(蓝色条)和手动使用广泛使用的真空歧管(红色条)之间进行了比较。

图4．四种标准量TSH 24次重复的中位荧光强度平均值。蓝条代表ELx50自动样品处理;红色条表示手工处理。误差条表示重复测量中的1个标准偏差。列中嵌入的百分比表示复制测量中的%CV。

显然，ELx50处理样品的MFI略高，表明水洗过程中珠粒回收率有所提高。此外，在一般情况下，提高精密度是注意到的，在较高的TSH浓度较低的cv。

蛋白质生物标志物- ELx405™磁洗

ELx405是一款全板清洗机，使用定制的钕铁硼磁铁，在96孔和384孔微板中进行基于磁铁的清洗。全板洗涤提供非常快速的样品处理，具有优良的洗涤效率和珠回收。图5展示了13 plex人类代谢激素面板的校准曲线。数据表明，使用ELx405在96孔微孔板格式中清洗基于磁性微粒的多重分析结果非常可靠。这些标准曲线可用于计算未知样品浓度，具有较高的置信度。

图5。使用磁性微球的13 plex人类代谢激素面板的校准曲线。

同样重要的是在分析中获得的精确程度。如图6所示，将磁性微球与ELx405磁珠清洗机(一种市售磁条清洗机)结合使用进行了比较，并通过使用相同磁珠的真空过滤集管进行了标准过滤器清洗。虽然标准曲线基本相同(数据未显示)，但在直方图中分析了三种样品处理方法中每种重复数据的精度，值得注意的是，ELx405产生了显著更高的精度，并且不容易出现因滤板堵塞而导致珠子损失的高方差数据。

图6．直方图描述了图5中数据点的频率，横坐标(x轴)上描绘了cv。

基因表达生物标志物- ELx405磁洗

正如在生物标记物工作流程中所指出的，基因表达生物标记物xMAP检测的样本处理相对于蛋白质生物标记物有更多的步骤，并且工作流程的自动化相对于人工处理具有显著的优势。去除未绑定材料是提供准确可靠数据的关键组成部分。在使用自动清洗机(如ELx405)时，井间均匀性取决于准确和可重复的分配量，低残留量和洗涤步骤中可靠的珠粒保留。通过结合纯化的已知RNA样本，使用ELx405磁珠清洗机在96孔微板中清洗检测时，可以检查信号响应的均匀性。
如图7所示，一种RNA的荧光信号在整个平板上是一致的。

图7．显示井间信号均匀性的地表图。作为36-plex QuantiGene Plex检测的一部分，NFKB1 RNA从96孔微孔板的所有孔中提取的纯化RNA中测量。然后用微软Excel绘制荧光信号。

一项艰巨的挑战是在384孔微孔板中执行清洗步骤。为了减少试剂使用量而减少样本量的需求已经为更高密度的平板格式提供了动力。然而，较小的井眼尺寸会使流体的抽吸变得更加困难。通过增加抽吸管相对于井底的高度，可以获得足够的清洗，而不会有明显的珠粒损失。

图8展示了ELx405™在384孔格式下清洗磁珠的能力。将从肝脏分离的纯化总RNA样本与通用参考RNA (URR)进行比较，从每个池中提取4个不同的样本，并分别进行4次重复分析。尽管洗珠和留珠存在困难，但空白井的信号仍然很低，而实验井的信号则要高几个数量级。此外，重复样本也有非常相似的结果。

图8。384孔反应板在不同RNA样品中RNA种类的表达

结论

我们已经证明了BioTek微板清洗机能够自动进行xMAP®生物标志物定量分析所需的清洗处理，无论这些生物标志物是蛋白质还是基因表达生物标志物，无论这些分析是基于聚苯乙烯还是磁性微球。自动化有助于简化和加快处理，但它也倾向于提高珠回收率以增加MFI，提高洗涤效率以减少本底，提高精度从而获得更好的分析性能。BioTek的三种不同型号的洗衣机为最终用户提供了三种不同级别的自动化:使用ELx50™的带式清洗，以降低吞吐量;采用ELx405全板清洗，提高通量;和EL406™，它具有ELx405的所有属性，用于洗涤应用，还能够分配xMAP®试剂，以实现更全面的样品处理自动化。

参考文献

1. http://www.luminexcorp.com/partners/index.html
2. 举行,保罗。使用ELx50过滤微板清洗机执行Luminex xMAP测定所需的洗涤处理步骤。申请须知载于www.aspinnursery.com2007年4月12日。
3. 举行,保罗。代谢激素检测的自动磁珠清洗。申请须知载于www.aspinnursery.com2009年9月18日。
4. 举行,保罗;阮,尼娜;Tran Bao-Huy;陆，平。“自动清洗磁珠QuantiGene Plex 2.0分析。”申请须知载于www.aspinnursery.com2009年9月16日。