二零零九年九月十八日
作者:Paul Held, BioTek Instruments, Inc.应用部门首席科学家;Nina Nguyen, Bao-Huy Tran, Stephanie Han和Binh Lu, QuantiGene产品公司二级参谋科学家和研发团队，乐鱼平台入口Affymetrix公司
摘要
通过对实验样品中mRNA种类的定量来表征基因表达是当今生物医学研究中常用的技术。的QuantiGene来自Affymetrix的®Plex 2.0检测试剂盒提供了一种同时从各种不同类型的样品中定量多种mRNA种类的方法。该技术使用铁氧体珠作为固体基质进行反应，在清洗步骤中需要一个磁场来保留珠。这里我们描述一下的用法ELx405™磁珠清洗机，使该检测技术的洗涤步骤自动化。
简介
通过RNA测量对基因表达进行定量和表征是当今生物医学研究的一项常见任务。通常情况下，通过定量PCR检测RNA的表达，这需要大量的RNA纯化和扩增。这些方法耗时、昂贵，而且容易出错。为了纠正这些问题，已经开发了替代方法。其中一种方法是QuantiGenePlex 2.0系统，它可以直接从组织匀浆、全血、培养的细胞裂解液或纯化的RNA中测量RNA，而不需要目标扩增。QuantiGene Plex 2.0系统使用分支DNA (bDNA)技术与多分析物磁珠(Luminex公司的xMAP®技术)结合，同时提供多个mRNA靶标的检测和定量。bDNA技术是一种基于杂交的方法，它使用标记的DNA探针来放大信号，而不是目标mRNA。xMAP技术使用流式细胞术和荧光染色微球(珠)，允许在单个样品中进行多达500个独特的分析。每一步杂化都需要彻底清洗一步，以去除未杂化的材料。为了提高检测的吞吐量和精确度，人们希望自动化检测所采用的清洗步骤。
图1。ELx405磁珠垫圈
基于微球的分析最初设计用于手动或半自动真空清洗系统，如ELx50™FMW[1]。虽然这些系统可以很好地满足低吞吐量的需求，但它们不能很好地满足高吞吐量分析的完全自动化需求。为了改善这种情况，并提供一个易于自动化的平台，新的微球技术被开发了部分涂覆超顺磁性氧化铁的技术。部分涂层仍然允许红色激光照亮微球内的染料混合物，这是珠识别所必需的。
ELx405™磁珠清洗机是基于ELx405微板清洗机的行业标准稳健设计。ELx405磁珠清洗机提供磁性微球的全板清洗。洗衣机采用了Dexter Magnetic Technologies公司定制的LifeSep™磁铁设计。两种不同的磁铁，每一种都带有高能钕铁硼磁铁，可以快速分离和保留微米和纳米级的珠子，设计用于96孔和384孔微板格式。
除了磁分离功能，ELx405磁珠垫圈还提供现有ELx405垫圈家族提供的所有标准和可选功能。与任何ELx405一样，磁珠清洗机适用于标准的ELISA洗涤，具有双作用™歧管，可独立控制吸入和分配管，以及可选的内置超声清洗机，便于无人值守维护。多达四个清洗缓冲的自动缓冲切换，以及使用内置键盘或通过液体处理控制™软件的PC控制的洗衣机控制的选择。
在这里，我们描述了检测的重要洗涤参数，并演示了ELx405自动化QuantiGene®Plex 2.0试剂系统所采用的洗涤步骤的能力。
分析依据
QuantiGene Plex 2.0系统可以直接从多种来源测量mRNA水平，包括培养的细胞裂解液、组织匀浆、干燥的血斑、福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)切片或纯化的RNA。它利用分支DNA (bDNA)技术，依赖于目标mRNA和特定探针集之间的合作杂交。探针集由三种寡核苷酸组成，捕获扩展子(CEs)、标签扩展子(LEs)和阻断子(BLs)，其序列是根据目标mRNA的序列选择的。捕获扩展体(CEs)是寡核苷酸，大约一半的序列与目标mRNA的片段互补，另一半与固定在捕获珠上的捕获探针(CP)互补。标签扩展物(LEs)也是寡核苷酸，其一半序列与目标mRNA互补，另一半序列与前置放大器的一部分互补。阻断探针(BLs)与目标mRNA的CE或LE寡核苷酸都无法识别的区域互补，有助于减少非特异性杂交。
CEs通过将目标mRNA与捕获珠结合，提供了检测的特异性。信号放大是LEs与靶mRNA和pre -放大器序列杂交的结果。然后将前置放大器主干与多个形成bDNA分支的放大器杂交。每个放大器的“分支”都有多个生物素片段，它们会与链霉亲和素共轭r - phyocythrin (SAPE)结合，SAPE是用于检测的可测量信号。使用这种技术，放大发生在信号而不是目标。该信号与靶mRNA成正比，无需纯化或扩增即可实现(图2)。该检测方法设计为使用BioTek的ELx405磁珠清洗机在批量或完全自动化模式下兼容。
图2。QuantiGene Plex 2.0系统概述。
材料与方法
按照检测试剂盒说明书中的描述进行QuantiGene®Plex 2.0检测。mRNA特异性探针集(使用前立即加热至95℃加热5分钟)、裂解混合物、mRNA特异性捕获珠、蛋白酶K和阻断试剂根据试剂盒说明进行组合，制成Working Plex集。每孔取20µL的Working Plex, 80µL的人总RNA和杂交板，密封，在54°C±1℃，600 rpm的振荡培养箱中孵育16-20小时过夜。
第二天，隔夜的杂交板被短暂地离心。内容物被转移到磁分离板上，并使用ELx405™磁珠清洗机(BioTek仪器)按照下面的洗涤说明进行洗涤。洗涤缓冲液包括190毫升无核酸酶水，0.6毫升洗涤缓冲组分1和10毫升洗涤缓冲组分2。洗净后，在使用前立即准备好100 μ L的前置放大器工作溶液，添加到每个孔中。重新密封，在50°C±1ºC下孵育60分钟，同时以600转/分钟的转速晃动。孵育后，再次用ELx405磁珠清洗机清洗板，然后在每个孔中加入100µL的放大器工作溶液(使用前立即准备好)。重新密封并在50°C±1ºC条件下以600转/分钟的转速震动孵育60分钟。再次用ELx405磁珠清洗机清洗板，并在使用前立即准备好100 μ L标签探针工作液，添加到每个孔中。重新密封并在50°C±1ºC条件下以600转/分钟的转速震动孵育60分钟。标记探针杂交后，再次按上述方法洗涤珠粒，每孔加入100µL的SAPE工作试剂。 The plates were resealed and incubated for 30 minutes at room temperature (RT) while shaking at 600 rpm. Following SAPE binding, the beads were washed as described using SAPE Wash Buffer rather than standard wash buffer. Each well then received 130 µL of SAPE Wash Buffer, placed on a shaking platform set to 600 rpm for 2-5 minutes at room temperature. Following resuspension, the samples were then read using a Luminex 100/200 reader (See Figure 3).
图3。QuantiGene Plex 2.0检测协议使用ELx405选择磁珠清洗机。使用60秒的初始浸泡时间捕获珠子，洗涤程序包括一系列的吸入和分配步骤，每个步骤都在磁化浸泡下执行。
洗涤说明
使用ELx405磁珠清洗机(BioTek仪器)进行自动洗板。洗衣机的编程“链接”功能用于将浸泡程序(Soak60)链接到两种不同的洗涤程序之一，这取决于板矩阵。浸泡程序允许60秒的珠被磁铁捕获，而洗涤程序分配和抽吸100µL或80µL的液体分别到96孔或384孔板。清洗程序还利用周期之间的短浸泡程序，以便重新捕获液体分配期间重新悬浮的任何珠子。每个步骤的具体参数列在表1中，不同的吸进和分配管的物理位置，以适应96孔或384孔微板。这些参数已经优化了珠的保留和洗涤效率。
程序名Soak60
BK96
BK384
链接文件
文件类型
浸泡
洗
洗
方法
清洗缓冲
一个
一个
板式
96
384
循环次数
3.
3.
浸泡/握手
是的
是的
浸泡时间
60秒
15秒
15秒
浸泡前先摇一摇
没有
没有
主要的
没有
没有
'卷
主要流量
分发
分配数量
One hundred.
80
分配流量
1
1
分配的高度
120
095
水平分配位置
00
00
水平Y位
00
00
先洗底
没有
没有
底部分配体积
底部流量
底部分配高度
底部分配位置
主要的
没有
没有
'卷
主要流量
愿望
理想的高度
48
48
水平吸气位置
-45年
00
愿望率
1
1
愿望延迟
00
10
横向送气音
没有
没有
横向吸上
横向的高度
横向水平位置
最后的愿望
是的
是的
最终吸气延迟
0000毫秒
0010毫秒
表1。用于QuantiGene®Plex 2.0检测的ELx405™磁珠垫圈设置。
结果
这些数据证明了ELx405磁珠清洗机能够有效地执行QuantiGene Plex 2.0试验所需的清洗。在与Affymetrix的合作中，我们运行了一系列QuantiGene Plex 2.0检测。这些基于杂交的分析使用特定的探针集，以捕获和量化特定的RNA物种。在进行了一夜的初始RNA捕获之后，分析使用一系列洗涤步骤、试剂添加和控制温度孵育来扩增目标物并结合荧光信号(图3)。
图4。多重反应中不同珠型的平均珠数。
通过在10倍试验中观察不同珠型的珠数来评估珠回收率。在加入每种珠子类型的1000颗珠子后，这些珠子在Luminex阅读器上读取之前，要经受相同的试剂、洗涤缓冲液和洗涤次数。Luminex读取器被配置为每种类型至少数100个珠子，或者总共数45秒。
如图4所示，来自32个不同孔的10-plex试验的所有不同珠型的平均珠数为106个或更多。
图5。特定井位的珠数。
此外，在读取器进入下一口井之前，所有不同类型的珠珠都记录了至少100个珠珠，这是基于时间而不是珠珠数量(数据未显示)。这表明，经过5个单独的3个循环的清洗程序后，所有井中都有足够数量的珠子。10种不同珠类的计数的低变异性表明其平均数的变异性是起始珠浓度差异的一个指标。当检测单个井的珠珠总数时，平均计数为1267±16个珠珠(图5)。此外，每个井的珠珠总数几乎相同，这表明在整个96个井板上进行的清洗是均匀的。
在使用QuantiGene®Plex检测时，去除未绑定的材料是提供准确可靠数据的关键部分。对于使用自动化仪器，如ELx405™磁性洗珠机，井与井之间的均匀性取决于精确和可重复的分配体积，低残留体积和可靠的洗珠保留步骤。通过使用36-plex house-keeping基因检测结合纯化的已知RNA样本，当使用ELx405磁珠清洗机在96孔微板中清洗检测时，信号响应的均匀性可以被检验。如图6所示，一种RNA的荧光信号在整个平板上是一致的
图6。显示井间信号均匀性的地表图。作为36-plex QuantiGene Plex检测的一部分，NFKB1 RNA从96孔微板的所有孔中aliase的纯化RNA中测定。然后用Microsoft Excel绘制荧光信号。
当用同样的36-plex检测其他不相关的RNA物种时，可以观察到类似的结果。表2给出了在96孔板的所有孔中对同一RNA池进行alialiase时，返回荧光信号的平均值和%CV。通过设计，这些不同RNA物种的拷贝数旨在彼此相似，以减少检测伪影。平均而言，所有36个RNA靶标的CV为9.2%，显著低于许多真空清洗过程中发现的典型的≥15%的CV。
＃ |
目标 |
的意思是 |
%的简历 |
1 |
ABCB4 |
819 |
7.68 |
2 |
NFKB1 |
1459 |
7.86 |
3. |
RELA |
1196 |
8.63 |
4 |
IFNG |
1041 |
7.40 |
5 |
肿瘤坏死因子 |
967 |
11.37 |
6 |
UGT1A8 |
917 |
8.64 |
7 |
UGT1A9 |
1520 |
9.34 |
8 |
ABCB11 |
1540 |
8.66 |
9 |
ACTB |
1250 |
9.12 |
10 |
IL1B |
2533 |
9.69 |
11 |
TNFRSF6 |
373 |
8.12 |
12 |
坏 |
1285 |
9.27 |
13 |
CYP2B6 |
1253 |
7.82 |
14 |
CSF2 |
1494 |
10.32 |
15 |
TNFSF6 |
3235 |
9.98 |
16 |
IL8 |
262 |
13.07 |
17 |
PPIB |
1021 |
8.59 |
18 |
VEGF |
2166 |
12.05 |
19 |
ABCC2 |
1309 |
8.55 |
20. |
IL10 |
1624 |
8.90 |
21 |
GAPDH |
1604 |
9.20 |
22 |
ABCB1 |
1664 |
9.45 |
23 |
CYP3A4 |
511 |
9.59 |
24 |
SLC22A7 |
1825 |
8.89 |
25 |
体内CYP2A6基因表现 |
981 |
9.21 |
26 |
CYP1A2 |
1358 |
10.75 |
27 |
IL2 |
806 |
8.05 |
28 |
IL6R |
1501 |
8.49 |
29 |
PTK2B |
968 |
9.06 |
30. |
CDKN1A |
680 |
9.06 |
31 |
UGT1A4 |
1248 |
9.92 |
32 |
柷 |
644 |
9.70 |
33 |
BCL2 |
962 |
8.02 |
34 |
UGT2B10 |
796 |
7.43 |
35 |
UBT2B7 |
773 |
11.60 |
36 |
UGT2B4 |
494 |
8.62 |
表2。QuantiGene Plex 2.0信号均匀性使用ELx405选择磁珠垫圈。使用人类总RNA进行36-plex检测。数据表示96次测定的平均值和%CV。
当不同样品在96孔或384孔微板上定量时，观察到非常一致和相似的结果。图7使用10- Plex QuantiGene Plex 2.0试验比较了两种不同人类总RNA样本中10种不同RNA的水平。每个数据点是样本的四个不同重复的平均值。在所有RNA种类中，两种RNA来源之间的RNA水平有显著差异。此外，空白孔(无RNA)相对于实验样品有非常低的信号(<10)，表明确定的信号不是洗得不好的人工制品。
图7。96孔反应板对不同RNA样品中RNA种类的表达。10-plex QuantiGene®Plex 2.0检测在人类总RNA上进行，并与人类RNA样本中的水平进行比较。数据为4次重复的平均值。
更困难的挑战是在384孔微板中执行清洗步骤。减少样本量以减少试剂使用量的需求为高密度板格式提供了动力。然而，井的尺寸越小，流体的吸入就越难保持珠粒。通过增加抽吸管相对于井底的高度，可以获得足够的清洗，而不会有明显的珠子损失。
图8展示了ELx405磁珠清洗机以384孔格式清洗磁珠的能力。再次，比较两个不同的人类总RNA池，从每个池中提取4个不同的样本，每个重复进行4次分析。尽管在清洗和保留微珠方面存在困难，空白井的信号仍然很低，而实验井的信号则高了好几个数量级。此外，重复样本的结果非常相似。用%CV测定，在384孔格式中，使用磁性清洗剂的测定精密度小于15%。
讨论
过去十年见证了悬浮阵列的发展，特别是Luminex xMAP®技术。这种技术允许生物分子分析的灵活性，以及允许在单一反应中复用分析物。这大大降低了分析的固有成本。此外，反应动力学类似于基于溶液的化学，这是一个明显的优势相对于平面，芯片阵列。乐鱼平台入口Luminex试剂合作伙伴可提供用于基因分型、基因表达和蛋白质应用的产品。与Affymetrix合作，BioTek开发了一种磁珠清洗机，能够自动化并提高基于磁珠的基因表达检测的精度，但该技术也可以用于改进Luminex合作伙伴定义的应用空间中的复用检测。
图8。用384孔反应板在不同RNA样品中表达RNA。
与ELx405磁珠垫圈一起提供的Dexter磁性技术公司定制的LifeSep™磁铁板提供了许多现成的磁铁的优势。这两种不同的磁铁分别适用于96井或384井的应用。96井的版本使用8个磁铁棒穿过12口井的中心。换句话说，每一行(a - h)都有一个单独的磁铁。同样的，384孔的版本有24根磁棒，穿过板柱的中心。因为磁铁没有覆盖整个井底，所以洗井器的吸入管可以远离珠子，防止珠子在吸入过程中丢失。通用磁铁还减少了可与96个不同磁铁相关联的不同磁铁之间的可变性。磁铁也可拆卸，便于清洁和安全存储时，不使用。它们的强磁场(96井为6800高斯，384井为4300高斯)也提供了快速珠粒分离。
参考文献
- 使用ELx50过滤微板清洗机执行Luminex xMAP测定所需的洗涤处理步骤。BioTek应用说明，www.aspinnursery.com．