荧光涂片镜检抗酸菌(AFB)自动评分

作者:温蒂·古德里奇，安捷伦科技公司

摘要

分枝杆菌属中的细菌菌株具有独特的细胞壁结构，可用于通过抗酸染色分析来区分它们，因此它们被称为抗酸细菌(AFB)。一些人类和牲畜疾病是由AFB引起的，显微镜方法被用作筛选过程的一部分，以确定潜在暴露者的AFB推定阳性样本。这些样本通常在根据放大倍数不同的视场(FOV)上每个视场的AFB计数数量所描述的类别内进行评分。手工操作时，由于操作人员的视觉疲劳或操作人员之间的识别差异，可能会导致数过或数过少。本应用说明描述了一种自动显微镜和分析方案，作为AFB评分的替代方法，可以比手动评分提高准确性和重现性。

简介

耐酸细菌(AFB)有一种特性来自于其细胞壁外膜的组成，其中含有相当大的百分比(40 - 60%)的霉菌酸。这些长链脂肪酸形成一层厚厚的脂质层，在不同的染色技术中对酸醇脱色剂具有抵抗力。利用这一特性的两种常见的AFB染色方法使用荧光染色剂Auramine O和Auramine O-rhodamine b。这些荧光团是高度亲脂的，因此在荧光显微镜下对AFB显示出很强的亲和力，从而在非特异性背景下获得清晰的明亮染色。这些染色方法的一些局限性包括不能识别分枝杆菌的单个菌株和染料的致癌性，然而AFB的荧光染色方法易于执行，经济有效，并产生快速的结果。因此，它们已被采用到使用荧光涂片显微镜筛查抗酸细菌的工作流程中，最显著的是作为病原菌株诊断筛查方案的一部分结核分枝杆菌这种疾病的原因肺结核(结核病)。通过对标准2 × 1 cm样本涂片扫描计数多个视场(FOV)得到AFB总评分，该评分依赖于放大倍率，FOV的数量依赖于客观放大倍率。^2、3

表1描述了评估AFB的典型标准，假设在普通手工显微镜上物镜的总放大率和一个补偿眼存在。

结核分枝杆菌典型表现为长1 ~ 10 μ m、宽0.2 ~ 0.6 μ m的棒状物体，通常呈弯曲、弯曲、颗粒状或珠状，但并不总是如此。一个标准的阳性涂片可以包含高度融合的混合细菌呈现，包括簇状和肿胀的细胞。⁴由于AFB的体积小，形态变化大，而且需要计算单个样本区域的数量，手工AFB评分繁琐且容易出错。在AFB评分中，操作员视觉疲劳被认为是限制显微镜检查的一个原因。⁵在一定程度上，为了帮助缓解这一问题，世界卫生组织于2011年验证并推荐了基于led显微镜的结核病荧光涂片筛查。⁵

质量控制载玻片通常用作标本涂片每次测试的阳性和阴性对照，原因有很多，包括作为建立和确认显微镜的正确功能和设置的手段因此，QC涂片包含抗酸阳性和阴性细菌的混合物，包括失活细菌结核分枝杆菌H37Ra被认为是利用倒置数字广域显微镜荧光通道开发AFB筛选自动化成像和分析方案的良好模型。所使用的自动显微镜由蒙太奇和拼接算法定义的软件控制，能够对样本的多个相邻区域进行成像和分析，从而得出最终的AFB评分。这种自动化方法可以作为一种方法来减少显微镜检查人员的视觉疲劳，并通过提供手工评分的替代方案来增加检查的吞吐量、准确性和可重复性。与所有筛选方法一样，假设实验室将根据各自的方案和专业知识验证并建立自己的最佳配置和设置。这是特别重要的转换FOV区域从手动显微镜到数字显微镜没有眼睛补偿。图1比较了本应用笔记中使用的自动数字显微镜的代表性图像尺寸和假设涂片尺寸为2 × 1 cm (L × W)的手动显微镜的理论配置。

表1。荧光涂片显微镜筛查AFB的标准示例。²

图1所示。(A)从用于自动AFB筛选方法的数字显微镜上获得的20倍和40倍物镜与具有眼代偿的理论非数字显微镜相比，在一个视场中使用20倍和40倍物镜的代表性结果(B)。

方法

染色分析

如上所述，BBL AFB载玻片(BD部件号231391)上的阳性和阴性涂片在甲醇中固定。^7、8固定，风干涂片按照BD TB荧光染色试剂盒T(部分编号212521)的程序进行染色，但涂片在试剂池中染色，而不是在载玻片上流动试剂染色。试剂在高压釜中经过25分钟的去离子水冷却后，用0.2 μ m的膜过滤，放入无菌的500ml洗涤瓶中。涂片晾干后放入三缓冲甘油(pH 9.0±0.5)和0.1%叠氮化钠溶液中，或使用Shandon Shandon- mount (Thermo Fisher Scientific部件编号1900331)和盖滑。载玻片要么立即成像(甘油安装)，要么在室温黑暗中过夜(山东安装介质)。与甘油相比，山东培养基有一些优点:山东硬治疗更适合倒置成像，通过盖层而不是显微镜载片获得略高的分辨率;荧光信号随时间的变化而保持;并有能力储存样品长期保存记录或重新成像，如果需要。图2显示了染色试验的摘要。

图2。概述用于演示AFB自动评分的染色试验工作流程。AFB抗酸性酒精脱色，因此保留原色。然后，可以使用荧光显微镜对它们进行区分和枚举，如本应用说明所示，使用安捷伦BioTek Lionheart FX自动显微镜和安捷伦BioTek Gen5微孔板阅读器和成像仪软件。2022世界杯附加赛决赛

成像分析

载玻片被装入安捷伦BioTek载玻片适配器(部件号122022世界杯附加赛决赛20548)或安捷伦BioTek 4载玻片支架(部件号1650516)，包括盖向下(山东)和/或盖向上(甘油)配置(数据未显示)。使用安2022世界杯附加赛决赛捷伦BioTek Lionheart FX自动显微镜，由安捷伦BioTek Gen5 Image Prime软件控制，使用20x(零件号1220517)、40x(零件号1220544)和/或60x(零件号1220545)物镜对载玻片进行成像，校正圈设置为0.17(盖玻片向下)或1.00(盖玻片向上)。用GFP滤光片立方体(零件号1225101)和465 nm LED立方体(零件号1225001)对30张图像进行6 × 5蒙太奇染色。罗丹明染色使用带有523 nm LED立方体(零件号1225003)的RFP滤光片立方体(零件号1225103)进行成像。使用阳性对照涂片确定每个目标的最佳曝光设置，然后应用于阳性和阴性对照的所有图像。使用滚动球大小为金胺2µm和罗丹明5µm的图像预处理设置对图像进行背景校正，结果都很好，平滑系数为2。在图像预处理后，使用线性混合方法在GFP通道上拼接蒙太奇，不缩小图像。在金胺染色物(GFP通道)上定义1 - 13 μ m的初级掩膜，信号阈值为9,108。在RFP上定义了一个最小扩展(1 × 10⁷)主掩模的周长区域来定义一个高于背景1472的阈值。为了计算RFP阳性的GFP对象总数的百分比，在大于或等于次级掩模分析得出的最低RFP信号强度的对象上定义了一个亚种群。掩蔽大小和信号阈值取决于图像背景校正选项。由于AFB的染色强度和倾向表现为单个、集群和/或重叠的细胞，图像背景校正和掩蔽阈值可以根据协议和染色技术定制。幻灯片图像覆盖下来，安装在固化的山东的代表性结果如图4至9所示。

结果与讨论

QC AFB阳性和阴性对照涂抹在直径15毫米的冲压圆形区域内，定义的蒙太奇尺寸设计为该区域内的代表性，以证明原理。在安捷伦Bio2022世界杯附加赛决赛Tek Gen5软件中，根据使用的目标，一个蒙太奇可以获得多达2000张图像。图3突出了为两种物镜放大设计的蒙太奇，以及可以根据涂片的大小和位置调整的蒙太奇定位值(显示为浅绿色)。需要注意的是，20x (51 × 35 = 1785张图像)仅需一个成像步骤即可对2 × 1cm的涂片进行成像，而40x (102 × 70 = 7140张图像)则需要多个成像步骤依次定义的蒙太奇来对同一涂片区域进行成像(图3，蓝色箭头)。此外，蒙太奇定义假设每个样本的涂片大小和位置相同。有两种方法可以解决这个问题:总是在样本幻灯片上标记用于涂抹的相同区域，或者使用水平和垂直定位值来调整蒙太奇区域(图3，粉色箭头)。这些可以通过物理测量涂片在载玻片上的位置并转换为微米单位(μ m)来确定，或者通过扫描载玻片使用亮场通道来获得位置值(图3，绿色箭头)。一旦蒙太奇区域被定义，通过从偏移中心向左向右等距离移动图像。

图3。蒙太奇成像区域(黑色)取决于客观放大倍率和感兴趣区域的位置。本例假设在标准显微镜载玻片的地理位置中间有一个2x1厘米的涂片(浅绿色的云)。

图4显示了6 × 5蒙太奇的阳性(4A)和阴性(4B)对照的拼接图像。可见阳性对照含有大量AFB，阴性对照不含AFB。采集后，图像背景校正为单个瓷砖，然后缝合成最后的蒙太奇。这两个控件都是用相同的设置捕获、预处理和拼接的。我们发现，由于阴性对照中缺乏信号(数据未显示)，拼接前的预处理可能导致一些瓷砖无法解决。拼接后的预处理导致较低的阈值，但细胞数量保持相对不变。如果在拼接过程中出现未解决的错误，应该在背景校正之前进行处理。

图4。使用20x显微镜物镜，在包含30个视场的最终缝合图像中，阳性对照(A)和阴性对照(B)的单一瓷砖视图。

拼接过程中，相邻的单个蒙太奇瓷砖之间的重叠被渲染为一个区域，从而消除了最终蒙太奇中重复计算物体的可能性(图5)。如果需要，重叠值可以自定义。然而，如果分析蒙太奇单个块的细胞计数，而不是拼接图像，相邻图像(X和Y)之间的重叠区域应该被考虑到最终的细胞计数。重要的是，由于AFB的尺寸较小，为了保持图像的完整分辨率，最大限度地实现拼接精度，应关闭拼接界面内的图像缩小选项。

图5．顶部:单个相邻的蒙太奇瓷砖;底部:缝合图像的一部分，显示两个相邻的瓷砖。红色箭头表示在单个瓷砖和缝合的图像之间对齐。黄色区域显示两个相邻瓷砖之间的图像重叠，成为缝合图像中的单个区域。

使用GFP荧光通道金胺染色的初级掩膜阈值进行AFB计数。用RFP荧光通道对罗丹明染色进行二次掩蔽，以确定双染物。图6A显示了两种荧光通道对AFB的典型成像和计数。图6B说明了如何根据一些指标来描述被统计的对象，例如，使用散点图和直方图来补充对象亚种群、形态剖面或染色模式的数据。所示的直方图表明，80.6%的涂片总对象为双染色阳性，并且这些对象具有较高的平均RFP信号，这是亚群体分析的结果。

图7显示了四种不同的阳性和阴性QC涂片的AFB计数和评分标准，如表1所示。左边是4个对照涂片的6 × 5缝合蒙太奇的总金胺和双染色计数，右边是每个视野的平均计数，通过将总缝合计数除以蒙太奇的视野数(30)来计算。

图6。(A)如单张图像所示，金胺20倍的主掩蔽产生总计数(紫色)，次级掩蔽和亚种群分析识别和计数同样为罗丹明阳性的物体(白色/浅灰色)。对一个区域的缩放显示不带掩蔽(右)。(B)蒙太奇分析结果的散点图显示了已统计物体总数的分布(黑点)和同时为金胺和罗丹明阳性的物体总数的百分比(红点)。

图7．根据表1的标准，具有代表性的阳性(A)和阴性(B)涂片蒙太奇图像的最终得分。

图8显示了金胺和双染色物体之间计数差异的一个可能解释。罗丹明的染色强度比金胺更低，变化更大，尽管预处理期间定义的背景校正罗丹明比金胺保留更多信号。由于罗丹明的信号识别能力下降，在亚种群分析中，部分目标呈现在设定的背景阈值以下，并通过金胺阳性目标的二级掩蔽准则排除。

图8。从多个涂片的蒙太奇结果来看，罗丹明的染色强度比金胺更低，也更多变。

在掩蔽过程中，罗丹明的非特异性染色模式也被揭示，通过一些呈现罗丹明染色和AFB形态的非金胺阳性的物体显示。图9使用了60倍放大的高分辨率物镜来说明这一点。右边图像中的紫色物体是从左边图像中检测到的金胺/罗丹明阳性物体。虽然右侧没有出现不加区分的金胺染色，但箭头显示有一些罗丹明伪物。QC阳性对照涂片中有两株不耐酸，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。罗丹明除了亲脂性外，更普遍地插入细胞DNA，因此这些非afb菌株的罗丹明染色可能更普遍，可能是导致染料非特异性染色模式的原因。经分析有代表性的阴性对照QC涂片，只含金黄色葡萄球菌而且大肠杆菌，掩盖3个Auramine objects，其中1个双重染色阳性。而以罗丹明通道为主要掩膜，共检测到罗丹明阳性和金胺阴性90个客体。通过减小罗丹明上的滚动球的尺寸来进一步平坦背景，只能部分解决这种染色模式的发生率(数据未显示)。罗丹明非特异性染色的这种趋势表明，金胺是掩盖AFB物体总数的更可靠的主要染色方法，但罗丹明阴性的金胺阳性物体很可能是AFB的无限期。

图9。在更高的分辨率下，可以从未被金胺阳性掩盖的伪影中观察到罗丹明的非特异性染色模式(箭头)。

结论

以AFB阳性和阴性QC涂片的荧光染色为模型，开发了一种可用于典型AFB计数工作流程的自动显微镜和分析程序。这种方法可以缓解视觉疲劳和/或手动评分可能产生的操作员变异性。自动预处理步骤增加了信号对比度，提高了目标识别的灵敏度。一些伪影可能会被包括在分析中，不管预处理是怎样的，尽管在积极的背景校正中较大的伪影将会被排除在外。相反，一些AFB阳性细胞由于处于最佳聚焦高度之外而分解为弱染色，可以排除在分析之外。采用蒙太奇和拼接的方法获取多个视场，扩大在大涂抹区域内获取目标，并可根据应用协议进行定制。基于AFB的小尺寸，建议关闭拼接图像缩小百分比，以保留最终蒙太奇内物体的最高分辨率。初步掩蔽导致自动计数金胺染色AFB对象。罗丹明的二级掩蔽和亚种群分析被用于计算金胺-罗丹明阳性的物体，并可以使用散点图显示为百分比分布。计数阈值应根据使用阳性对照的每个通道的结果确定，并在阴性对照和样本中一致使用相同的值。 Dual staining is advantageous to help increase confidence and accuracy in object counts, but of note, in the experiments done here, rhodamine stained with less intensity and more variability than auramine, predisposing auramine as a recommended primary stain for masking total object counts in AFB dual staining fluorescence screening assays. Higher resolution objectives can be employed on regions of interest with lower object counts, indeterminate object presentation, or to confirm morphology if required.

Agilent BioTek Lionheart FX自动化显微镜的额外2022世界杯附加赛决赛标准功能，可以扩大抗酸涂片显微镜的选择，包括一个6物镜转塔，适合2.5倍至100倍的浸油物镜;4个可互换的荧光/LED插槽;并且，除荧光成像外，成像模式还包括亮场、数字彩色亮场、相位对比和高对比度亮场。两个和四个滑座可供定制吞吐量。由于放大倍率较高的物镜工作距离较短，4滑块固定器在拍摄时只能拍摄40倍的物镜，而在拍摄时只能拍摄20倍的物镜。为了实现不间断高通量工作流程的自动化，安捷伦BioTek BioStack 4机械臂可以与安捷伦BioTek C2022世界杯附加赛决赛ytation 5或安捷伦BioTek Cytation 1细胞成像多模式读取器集成，该读取器具有与安捷伦BioTek Lionheart FX相同的许多功能，除了油浸泡。当考虑仪器配置选项时，一个4倍的物镜可能用于幻灯片扫描，以更快地找到感兴趣的成像区域。

参考文献

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