用于通用GPCR传感器的均相Phospho-ERK1/2检测的自动化处理-均相LanthaScreen®细胞检测

作者:保罗·赫尔德和彼得·班克斯，BioTek仪器公司维努斯基，佛蒙特州;克里斯汀·胡威勒，马修·罗伯斯和邦妮·汉森，生活的技术，麦迪逊，威斯康星州

摘要

GPCRs的激活可导致许多信号网络的刺激，其中许多已被证实可导致细胞外信号调节激酶1/2 (ERK1/2)的磷酸化。因此，ERK1/2磷酸化的测定可以作为GPCR激活的替代品。我们将bacmam介导的GFP-ERK2传感器基因传递与LanthaScreen®细胞分析技术相结合，用于基于时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)的细胞内磷酸化erk2水平测量。这些技术结合在一起形成了一个灵活的平台，可以测量任何感兴趣的细胞系的GPCR激活。在这里，我们演示了该分析可以在均匀的格式中执行，并适应于自动化。

简介

针对g蛋白偶联受体(GPCR)超家族成员的药物是现代医学的核心，占当今市场上最畅销药物的大多数，约占所有处方药的40%。细胞膜受体如受体酪氨酸激酶(RTK)和g蛋白偶联受体(GPCR)通过几种不同的信使网络介导胞外信号从细胞膜到细胞核。根据信号的持续时间和强度，细胞会对信号进行解释并产生不同的反应。细胞外信号调节激酶(ERK)已被证明是通过许多不同途径从细胞表面受体传递这些生长和分化信号的中心中介因子(图1)。

图1．MAPK/ERK1/2激活来自GPCRs的描述。

配体结合可通过多种机制导致ERK1/2磷酸化。结合受体酪氨酸激酶(RTKs)诱导对接蛋白的招募。Ras蛋白随后被激活，导致RAF激酶的激活，从而启动MEK1/2和ERK1/2的磷酸化级联。MAPK/ERK通路也可以被GPCR激动剂激活。
这些机制可能涉及二级信使依赖性蛋白激酶，β -止动素的募集，或受体酪氨酸激酶活性[1]的转激活。

ERK1/2的磷酸化活化可以作为g蛋白依赖和g蛋白独立信号的替代标记。然而，直到最近，还缺乏与hts兼容的测量ERK激活的技术。我们已经开发了一种BacMam ERK1/2细胞检测方法，该方法将BacMam介导的GFP-ERK2传感器基因传递与LanthaScreen®细胞检测技术相结合，用于测量细胞内磷-ERK1/2水平。

BacMam病毒是一种改良的杆状病毒结构。杆状病毒是一种昆虫细胞病毒，对哺乳动物细胞无毒，但同时不能在哺乳动物细胞中复制。该病毒结构具有CMV表达调控元件，可提供约5天的高水平瞬时表达。该病毒结构，可以耐受大插入(高达38kb)，也能够难以转导转染细胞系，如原代或干细胞(图2)。

图2。BacMam病毒

BacMam ERK1/2细胞试验使用BacMam ERK2病毒转导活细胞，导致GFP-ERK2融合蛋白的表达(图3A)。当表达GFP-ERK2的细胞被刺激磷酸化ERK2并随后溶解时，铽(Tb)标记的检测抗体结合ERK2上的双磷酸化(Thr185, Tyr187)部分。这种关联使得激发态Tb荧光团和绿色荧光蛋白(GFP)之间发生能量转移，导致TR-FRET信号增加(图3B)。

图3．LanthaScreen®细胞分析原理图。（一个)激活表达GFP-ERK2融合蛋白的活细胞，促进ERK磷酸化。（B将含有tb标记的抗phospho- erk2 [pThr185/pTyr187]抗体的LanthaScreen细胞裂解液添加到细胞中。抗体的结合提供了从兴奋的供体荧光蛋白Tb到GFP的能量转移所必需的密切联系，导致TR-FRET信号的增加。
因此，phospho-ERK1/2传感器使用均相TR-FRET免疫分析法以细胞为基础检测ERK2蛋白的特定翻译后修饰。

材料与方法

按照Huwiler的描述进行了ERK1/2磷酸化分析等人。[2]进行了修改，使得在添加裂解缓冲液之前没有除去介质。简单地说，稳定表达GPCR的细胞系用BacMam ERK2试剂转导并冷冻保存。bacmam处理的细胞在实验前一天解冻，在低血清(0.1%)测定培养基中洗涤，接种到384孔板(25 μ L培养基/孔)，血清饥饿过夜。使用MicroFill的注射泵分别加入有或没有激动剂的培养基(5µL)，根据GPCR细胞系的不同，在RT中孵育6-8分钟。然后，通过加入含有LanthaScreen®Tb-anti-ERK2 [pThr185/pTyr187]抗体的(6µL)浓缩裂解缓冲液，使用MicroFlo运动泵和测量的trr - fret信号直接(不需要培养基吸入)裂解细胞(图4)。

图4。自动LanthaScreen®检测程序

为了进行D2多巴胺拮抗剂化合物筛选，冷冻保存的经BacMam ERK2转导的D2多巴胺细胞被镀在384孔板(15,000个细胞/孔)中，并在测定培养基中孵育一夜。第二天，以10 μ M的最终浓度向细胞中添加Tocris化合物组(1120个化合物)。然后使用MicroFill以100 nM的最终浓度将D2多巴胺激动剂添加到细胞中。细胞在RT下孵育8分钟，然后加入含有Tb-anti-ERK2 [pThr185/pTyr187]抗体的裂解缓冲液，使用MicroFlo和2小时后确定的TR-FRET信号。然后在第二天重复播放。在两天都显示出抑制活性低于临界值的化合物被评为“命中”。每个屏幕的命中率设置为6%(76/1120个化合物)。

结果

最初的实验测试了MicroFill的注射泵或MicroFlo的蠕动泵分配ERK1/2裂解缓冲液的能力。图5表明，当使用荧光素作为示踪剂时，任何一个点胶器都能够准确、精确地分配低容量(5µL)的粘性裂解缓冲液。无论使用哪种分配器，观察到的信号差异都很小，且% cv小于2%(数据未显示)。

图5。试剂分配器的分配均匀性。使用不同的分配器模块将含有荧光素染料的5µL裂解缓冲液分装到384孔微板的192孔中。荧光测定采用a协同作用2多模式微刻版阅读器。每个数据点代表16口井的平均值。

图6。自动和手动程序的比较。使用BacMam ERK2试剂转导的HTR1A GeneBLAzer®CHO细胞，使用MicroFill和MicroFlo分配器手动添加试剂。

将这种分配器与人工移液进行比较，以研究它们诱导激动剂pERK1/2反应的能力。使用MicroFill分配5µL的血清，作为激动剂或培养基，作为基础对照，然后使用MicroFlo添加含有tb -抗erk2抗体的裂解缓冲液。如图6所示，在LanthaScreen试验中使用自动分配试剂产生的结果与手动试剂移液获得的结果相当(图6)。同时，比较了慢速和快速的自动分配速率，发现两者相当。统计比较表明，自动化方法的响应比略小，但具有等效的z′因子(表1)。

表1。自动和手动液体处理的统计比较。

一个典型的实验是用MicroFlo加入含有tb -抗erk2抗体的裂解缓冲液，如图7所示。用不同浓度的BacMam病毒转导U2OS细胞，然后用不同浓度的EGF刺激U2OS细胞。在这些实验中，细胞对病毒数量增加的反应与预期的一样。只有接受病毒的细胞对EGF刺激有反应，而且这种反应依赖于病毒载量(图7)。

图7．用四种不同浓度的BacMam ERK2病毒转导U2OS细胞。第二天用EGF刺激细胞6分钟，然后用含有tb -抗磷erk2抗体的Cellular LanthaScreen®裂解缓冲液裂解细胞。确定TR-FRET信号，数据归一化到基础响应比。

使用MicroFill和MicroFlo自动化试剂添加，对D2多巴胺拮抗剂进行了复合文库筛选。数据的典型散点图如图8所示。测定了测试的1120个化合物的响应率，并确定了一个截止值，使6%的化合物(76/1120)被评为具有抑制活性。Tocris文库偏向于GPCR和离子通道结合化合物，因此6%的截断标准被认为是可以接受的。接着，屏幕又重复了一次。如图8所示，大多数化合物要么与D2多巴胺受体没有特异性的相互作用，要么是已知的激动剂。这些化合物的发射比(GFP/Tb)为0.06 ~ 0.08。6%的化合物的分界值，约为0.03，也被绘制出来(趋势线)。然后重复筛选，只有在两个筛选下限以下的化合物才被认为是真正的抑制剂(图8)。

图8。图书馆放映图。Phospho-ERK1/2值来自一个屏幕，并指示切断值。指示多日抑制剂的最终结果用红色数据点表示。

来自平板控制的初始筛选和重复筛选的统计数据表明，当使用自动分配器添加试剂时，分析的鲁棒性。对于所有测试的板，Z '因子统计值均为0.5或更高(表2)。

表2。筛选数据。每个384井板的控制井的Z′因子计算。

在第一次筛选后，对67种化合物进行得分，所有已知的D2拮抗剂都被识别出来。在随后的重复筛选中，55种化合物在最初的筛选中被确定为抑制剂，这两天也被确定为抑制剂。在这55种化合物中，20种是多巴胺受体抑制剂，4种是已知的MEK抑制剂。在这两个筛选中，所有已知的D2拮抗剂抑制剂都被识别出来。

讨论

这些数据表明，BioTek的MicroFill和MicroFlo等可用的分配器能够自动添加用于LanthaScreen®ERK2细胞检测的试剂。分配器能够准确、精确地提供适当数量的试剂。在并排比较中，使用MicroFlo和MicroFill Dispensers进行ERK1/2 LanthaScreen®细胞检测产生的误差比手动执行检测产生的误差更低，这体现在较低的标准偏差上。虽然使用MicroFlo和MicroFill分配器进行ERK1/2 LanthaScreen®细胞检测产生的响应率略低于手动检测时，但通过提高精度，Z′值是相当的。

使用该仪器和检测结合可以提供有意义的生物学信息。使用BacMam系统瞬时转导大量带有ERK2-GFP嵌合基因的细胞系的能力使研究者能够使用ERK1/2 LanthaScreen试验进行各种各样的研究。例如，使用MicroFill和MicroFlo分配器结合LanthaScreen®细胞磷酸化erk2试验，可以轻松、准确地筛选生物聚焦化合物库的D2拮抗剂活性。这些以细胞为基础的测定需要在短时间孵育后及时添加试剂。使用高度准确和精确的自动分配器使运行相当少的艰苦和更准确，如果尝试与手动移液器。

参考文献

Luttrell, D.K.和L.M. Luttrell(2003)时间和空间信号传递:G蛋白偶联受体和丝裂原激活的蛋白激酶。试验药物开发技术:327-338。

Huwiler, K.G, T. Machleidt, L. Chase, B. Hanson和M.B. Robers(2009)使用细胞外磷酸化信号调节激酶2传感器对5-羟色胺- 1a受体激活的表征。393:95-104。

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