代谢激素测定的自动磁珠清洗-使用ELx405磁珠清洗机清洗MILLIPLEX MAP测定

作者:Paul Held博士，BioTek仪器公司应用部门首席科学家

摘要

代谢综合征是冠心病的一组危险因素，中风和周围血管疾病以及2型糖尿病患有代谢综合征的成年人表现出一定程度的低度炎症，据信是由促炎因子和抗炎因子的失调引起的。因此，这一领域的研究包括无数不同的分析物，包括细胞因子、急性期蛋白、糖尿病的生物标志物、肥胖相关激素和心血管疾病。为了满足这些研究需求，Millipore开发了使用铁氧体珠作为固体基底的多重分析。这些珠子在洗涤过程中需要一个磁场来保持珠子。在这里我们描述的使用ELx405磁珠清洗机自动清洗步骤使用MILLIPLEX™MAP代谢激素测定面板。

简介

内分泌系统的细胞和器官产生的激素，包括脂肪细胞、胰腺和胃肠道，在调节身体的代谢状态中起着至关重要的作用。代谢综合征代表了一个人的一组危险因素，包括:中枢性肥胖;动脉粥;胰岛素抵抗;凝血状态;血压升高;还有促炎状态。患有代谢综合征的人患冠心病、中风、周围血管疾病和2型糖尿病的风险更高。该综合征与肥胖密切相关，多达4700万美国成年人被认为患有代谢综合征[1]。代谢综合征所列的许多危险因素是由代谢激素调节的。 As a result of the severity of this epidemic a large amount of research is being performed on the regulatory hormones associated with this disorder. Because there are a number of different hormones that act in concert, it is advantageous to be able measure a number of different analytes simultaneously from the same sample. The MILLIPLEX MAP Metabolic Hormone Assay Panel from Millipore uses xMAP® bead technology from Luminex to perform a 13-plex assay on samples. Despite using a multiplex reaction, many researchers still need to assay large numbers of assay samples.

基于微球的分析，如MILLIPLEX MAP分析，最初设计用于手动或半自动真空清洗系统，如ELx50™FMW[2]。虽然这些系统在低吞吐量需求时工作得很好，但它们并不能很好地满足高吞吐量分析的完全自动化需求。为了纠正这种情况并提供一个易于自动化的平台，开发了部分涂有超顺磁性氧化铁的新微球技术。

图1。ELx405™磁珠清洗机

ELx405™磁珠清洗机基于ELx405微板清洗机的行业标准稳健设计。ELx405磁珠提供磁性微球的全板清洗。洗衣机使用德克斯特磁性技术公司定制的LifeSep™磁铁设计。

两种不同的磁铁，每一种都是高能钕铁硼磁铁，可以快速分离和保留微米和纳米珠子，已经设计成适合96和384孔微孔板格式。

在这里，我们描述了分析的重要洗涤参数，并演示了ELx405™Microplate Washer自动化MilliPLEX™代谢激素分析面板所采用的洗涤步骤的能力。

测定依据

MILLIPLEX MAP检测珠由直径约5.6微米的聚苯乙烯微球组成，该微球已浸渍了铁氧体颗粒以及两种彩色染料的混合物。染料的相对体积经过仔细调整，以提供100种不同的颜色，可用于区分珠子，并提供一种同时测量微孔板中多达100种分析物的方法。分析物分子的捕获是通过将分析物特异性的一抗偶联到微球表面并使用荧光标记的报告标签结合到捕获的分子来提供的。在代谢激素分析的情况下，捕获分子将是针对激素分析物的一抗，报告标签将是针对生物素标记的蛋白质上不同表位的二抗。然后，荧光读数将使用藻红菊酯标记的链霉亲和素提供，它直接结合到二抗的生物素部分。结合藻红菊酯的量与分析物的量成正比(图2)。

图2。xMAP®检测原理．
A:捕获探针共轭;
B:待量化分析物的结合;
C:绑定报告标签，产生分析信号。

检测是用一个本质上是双激光流式细胞仪的设备完成的，其中微球被单独引导通过两个激光定义的检测体积，一个是绿色的，另一个是红色的。绿色激光激发藻红菊酯报告标记，并产生用于量化分析物的分析信号。红色激光激发珠内的染料混合物，并通过珠的类型确定正在测量的分析物(图3)。

ELx405磁珠清洗机是基于ELx405微板清洗机的行业标准稳健设计。ELx405磁珠清洗机提供磁性微球的全板清洗。洗衣机使用德克斯特磁性技术公司定制的LifeSep™磁铁设计。两种不同的磁性板，每个都带有高能钕铁硼磁铁，可以快速分离和保留微米和纳米珠子，已经设计成适合96孔和384孔的微孔板格式。磁铁是可拆卸的，便于清洗和安全存储时，不使用。96孔版本的强磁场为6800高斯，可提供快速的珠子隔离。

除了磁分离功能，ELx405磁珠清洗机还提供现有ELx405清洗机家族提供的所有标准和可选功能。与任何ELx405一样，磁珠清洗机适用于标准ELISA洗涤，具有双作用™歧管，可独立控制吸入和分配管，以及可用的内置超声波清洗机，便于无人维护。自动缓冲切换多达四个洗涤缓冲是可选的，以及使用内置键盘或PC控制的洗衣机控制，通过液体处理控制™软件。

材料与方法

Millipore MILLIPLEX™MAP人类代谢激素磁珠板，目录号HMHMAG-34K，用于评估ELx405磁珠清洗机的性能。生成一系列的校准曲线，并根据试剂盒说明书进行测定。简单地说，通过对重组的人体代谢标准的连续稀释(1:3)产生了七个工作的多重标准。这些标准包含13种不同的分析物。

重组后，分别将25µL的测定缓冲液、标准品、基质溶液和珠移液到测定微孔板中。反应在室温(RT)下孵育2小时，在摇板器上搅拌。孵育后，使用ELx405™磁珠清洗机(BioTek Instruments)按照以下洗涤说明进行清洗。洗涤后，加入50µL检测试剂或二抗试剂，在室温下搅拌孵育60分钟，然后加入50µL SAPE试剂。在搅拌孵育30分钟以使报告标记结合发生后，按照洗涤说明再次洗涤板，但留下100 μ L鞘液残留。然后用XPONENT软件在Luminex 200阅读器上读取样本(图4)。

图4。 MILLIPLEX™MAP检测协议使用ELx405磁珠清洗协议(见表1)。在初始浸泡时间为60秒以捕获珠子后，清洗方案包括磁化下的一系列分配、浸泡和吸附步骤。

洗涤说明

使用ELx405磁珠清洗机(BioTek Instruments)进行自动洗板。洗衣机的编程“链接”功能用于根据平板矩阵将浸泡程序(SOAK60)链接到洗涤程序(MAGX3)。浸泡程序允许磁珠捕获60秒，而清洗程序自动分配和吸气。清洗程序还利用了周期之间的浸泡程序，以重新捕获在流体分配期间重新悬浮的任何珠子。每个过程的具体参数如表1所示。这些参数已经优化了珠保留率和洗涤效率。

链接文件	微孔
程序名	SOAK60	MAGX3
文件类型	浸泡	洗
方法
清洗缓冲		一个
板式		96
循环次数		3.
浸泡/握手		是的
浸泡时间	60秒	60秒
浸泡前摇匀		没有
主要的		没有
'卷
最佳流量
分发
分配数量		200
分配流量		5
分配的高度		130
水平分配位置		0
水平Y位置		0
先洗底		没有
底部分配体积
底部流量
底部分配高度
底部分配位置
主要的		没有
'卷
最佳流量
愿望
理想的高度		35
水平吸入位置		0
愿望率		6
愿望延迟		0
横向送气音		没有
横向吸气
横向的高度
横向位置
最后的愿望		是的
最终吸气延迟		0毫秒

表1。ELx405磁珠清洗协议的MILLIPLEX MAP。

结果

使用已知浓度的分析物，通过绘制荧光信号对浓度的曲线，可以为每个代谢激素生物标志物生成一系列标准曲线。然后可以对这些标准曲线进行插值，以确定未知样品的浓度。与ELISA反应一样，为了获得有用的结果，高效洗涤以去除非特异性抗体结合是至关重要的。

然而，与酶联免疫吸附试验不同，酶联免疫吸附试验的固体表面是微孔板本身，而珠的保留同样重要。如图5所示，使用ELx405™磁珠清洗机以96孔微孔板格式清洗基于磁珠的多重分析，可获得非常可靠的数据。这些标准曲线可用于计算未知样品浓度，具有较高的置信度。

图5。Millipore MILLIPLEX™MAP 13-plex人类代谢激素面板的标准曲线。

有许多不同的方法来清洗基于多重磁珠的分析，包括底部过滤，结果足够精确的校准曲线。同样重要的是这些不同方法所获得的精确度。如图6所示，将磁珠与ELx405磁珠清洗机(一种市售磁条清洗机)结合使用进行了比较，并使用相同的磁珠通过真空过滤进行标准过滤器清洗。虽然标准曲线基本上都是相同的(数据未显示)，当在直方图中分析三种情况下每个重复数据的精度时，注意到ELx405产生了显著更高的精度，并且不容易出现高方差数据，表明滤板堵塞导致珠子丢失。

图6。直方图描述了标准曲线中数据点的频率，横坐标(x轴)上描绘了cv。

讨论

BioTek与Millipore合作开发了一种磁珠清洗机，能够自动化和提高不同类型磁珠分析的精度。Millipore的MILLIPLEX™分析是基于抗体的分析物捕获分析，用于量化蛋白质生物标志物。在本应用笔记中，我们演示了MILLIPLEX 13-plex人类代谢激素面板的使用。

定制的LifeSep™磁板从德克斯特磁性技术提供的ELx405磁珠垫圈提供了一些优势，比许多现成的磁铁。针对96井或384井的应用，设计了不同的磁体。96个井的版本使用8个磁棒穿过12个井的中心。换句话说，每一行(a - h)都有一个单独的磁铁。普通磁铁还减少了不同磁铁之间的可变性，可以与96个不同的磁铁相关联。

多种相关的，但明显不同的分析物在同一化验中很好地节省了大量的时间，试剂，以及珍贵的样品。然而，随着多重分析中分析物数量的增加，交叉反应和非特异性干扰的可能性增加。能够提供有力的清洗程序，同时保留检测珠是防止人为信号的一个重要因素。在这个例子中代谢激素:淀粉酶;胃促生长素;吉普赛人;GLP-1;胰高糖素;il - 6;胰岛素; leptin; MCP-1; pancreatic polypeptide; PYY; and TNF-a were assayed simultaneously with very good results in part due to the efficient washing provided by the ELx405 Magnetic Bead Washer from BioTek Instruments.

参考文献

1.福特ES，贾尔斯WH，迪茨WH(2002)。代谢综合征在美国成年人中的患病率:来自第三次全国健康和营养检查调查的结果。《美国医学会杂志》287(3): 356 - 359。

2.使用ELx50过滤微板清洗机执行Luminex xMAP测定所需的洗涤处理步骤。BioTek应用说明，www.aspinnursery.com．

确认

感谢肖强，密理孔公司，圣查尔斯，密苏里州提供13-plex人类代谢激素面板数据。