使用康宁氟块渗透性支架进行细胞迁移和侵袭试验的自动动力学成像

作者:布拉德·拉尔森，安捷伦科技公司，希拉里·谢尔曼，康宁生命科学

简介

转移，即产生疾病的因子(如癌细胞)从疾病原发部位扩散到身体的其他部位，与约90%的癌症相关死亡有关。因此，这是对该病管理的最重大的挑战。转移过程包括细胞从原肿瘤迁移(很多时候是对特定调节因子的反应)，然后侵入周围组织，有时是远处组织。

虽然有许多方法可以测量癌细胞的迁移和侵袭特性，但渗透性支架的出现提供了一种简单的体外方法来执行这些类型的分析。荧光阻断膜的加入提高了分析的准确性，并允许使用倒置荧光显微镜进行分析。这提供了精确计数到达膜底部的细胞数量的能力，而不是依赖于基于ppm的测量，后者更容易受到背景荧光的影响。

本应用笔记演示了使用一种新型细胞成像多模式阅读器监测细胞迁移和入侵的能力。动力学成像是通过使用温度和大气控制进行的。细胞计数也使用安捷伦BioTek中的细胞分析功能进行2022世界杯附加赛决赛Gen5数据分析软件。

材料与方法

材料

细胞

MDA-MB-231 RFP细胞(部分编号AKR-251)和MCF-7 GFP细胞(部分编号AKR-211)从Cell Biolabs, Inc.(San Diego, CA)购买。MDA-MB-231细胞在高级DMEM培养基(部分号12491- 015)+胎牛血清(FBS)， 10%(部分号10437- 028)和1倍(部分号10378-016)中繁殖，分别来自Life Technologies (Carlsbad, CA)。MCF-7细胞在MEM α培养基(部分编号12561-049)+胎牛血清(10%(部分编号10437-028)，PenStrep, 1x(部分编号15070-063)和人重组胰岛素(部分编号12585-014)中繁殖，同样来自Life Technologies。

试剂

CellTracker Green CMFDA染料(部件号C2925)购自Life Technologies。

2022世界杯附加赛决赛Agilent BioTek细胞分化3细胞成像多模式阅读器

Cytation 3结合了自动数字显微镜和传统的多模式微板检测，提供了丰富的表型细胞信息和基于良好的定量数据。Cytation 3特别强调活细胞测定，温度控制在45°C, CO₂/ O₂气体控制，以及用于动力学分析的双注射器。该仪器用于成像细胞迁移或入侵到fluorblock膜的底部。

2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek Gen5数据分析软件

Gen5软件控制Cytation 3的操作，用于自动数字显微镜和基于ppm的微板读取。从样本翻译、聚焦和曝光控制，图像采集是完全自动化的。蒙太奇功能允许在低密度板井的整个表面捕获图像，例如用于该应用的24井渗透支架。最后，图像分析允许对每张图像进行细胞计数，并报告每口井的总结果。

康宁fluorobk细胞培养插入物

fluorobk细胞培养插入物采用聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜设计，可有效阻挡490至700纳米之间的光的传输，允许以简化和非破坏性的方式进行荧光检测。

在插入物的顶部腔室中存在荧光标记的细胞与底部读取的微生物板阅读器或显微镜隔离。该非破坏性检测方法可以实现动态和端点迁移和入侵分析。使用fluorblock HTS 24孔透性支撑系统(部件号351158)进行细胞迁移分析，而BioCoat Tumor Invasion 24孔板(部件号354166)包含基质基膜提取物(BME)涂层，用于检查细胞侵袭。

方法

细胞制备和分配到氟块插入

收集细胞，在适当的无血清培养基中稀释至浓度5.0 × 10⁵细胞/毫升。然后用5 μ M浓度的CellTracker Green CMFDA染料标记MDA-MB-231细胞，使用制造商的协议处理30分钟。对于细胞入侵实验，在分配细胞之前，插入物在潮湿的37°C环境气氛培养箱中用500µL的温磷酸盐缓冲盐水再水化2小时。在复水化培养时间后去除缓冲液。无血清培养基或含10%胎牛血清的培养基，体积为1ml，移至基底外侧腔，然后将200 μ L的细胞悬浮液放入适当的插入物中。

基于动态图像的细胞迁移和侵袭监测

含培养基和细胞的氟块板立即放入安捷伦BioTek细胞3中，温度和气体控制预先设置为37°C/5% CO2022世界杯附加赛决赛₂．每口井都使用4倍物镜和4行3列图像蒙太奇完成成像。由于光能够通过插入膜中的孔，因此使用光场通道进行聚焦。自动对焦功能使成像仪通过基底外侧隔室的底部聚焦到细胞层。然后设置二级通道，以检测来自细胞的组成表达荧光蛋白(RFP或GFP)的信号，或来自细胞追踪器绿色染料的信号。还选择了不连续动力学程序，在24小时潜伏期内，每两小时对每个指定井进行一次成像。

2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek Gen5细胞分析

使用Gen5软件对捕获的4x图像进行细胞分析。这样做是为了检测迁移或入侵到膜底部的细胞的实际数量，而忽略图像的所有其他部分。表1和表2描述了用于计数带有GFP或RFP通道的单元的参数。

从蒙太奇的每张图像中统计出来的细胞被组合起来，报告为每个特定时间点上每口井的总数。

表1。4 × GFP图像细胞分析参数。

表2。4 × RFP图像元胞分析参数。

结果与讨论

细胞迁移分析

从含有10%胎牛血清的阳性对照孔和含有无血清培养基的阴性对照孔捕获的图像的视觉分析中，可以明显看出，MCF-7细胞对强化学引诱剂(如血清)的反应，在8.0 μ m膜上迁移(图1)，这在文献中已经显示过

然后使用Gen5数据分析软件的细胞分析工具，使用表1中先前描述的参数进行分析。同时测定每组采集图像的总荧光。

MCF-7细胞对10%血清趋化剂的反应迁移的数量在孵育的头4小时内急剧增加，在随后的20小时内达到更稳定的迁移状态(图2A)。这可以用这样一个事实来解释:最初，细胞膜的孔中没有细胞。因此，细胞可以自由地向化学引诱剂移动。然而，细胞很可能以不同的速度迁移，有些细胞需要更长的时间才能穿过细胞膜。在最初的四个小时的孵育后，仍然会有细胞穿过细胞膜。这将减缓总体迁移速率，使其达到更稳定的状态。这与在最初14小时内保持稳定的基础迁移率相比，因为在阴性对照井中迁移率低得多，随后在最后的潜伏期几乎没有迁移。当绘制阳性对照和阴性对照孔的细胞计数比例时(图2B)，这产生了三个不同的迁移阶段:(1)对血清的高初始迁移与稳定的基础迁移;(2)缓慢、稳定的向化学引诱剂迁移结合持续的基础迁移;(3)正对照井运移持续，而负对照井运移不明显。

图1所示。．MCF-7细胞迁移的4倍蒙太奇图像。表达GFP的MCF-7细胞在10%或0%血清作用下迁移的动力学图像。使用GFP成像滤波器立方体和4倍物镜捕获的图像。

当检查荧光信号结果(图2C)时，可以看到值遵循与细胞分析相似的模式。然而，采用该方法后，正、负对照井的比值变化显著降低，最大值仅为2.4。这是由于使用这种分析技术时检测到固有的荧光背景信号。这样的结果可能导致关于特定细胞类型迁移能力的错误假设在活的有机体内反应将是对一种特定的化学引诱剂。结合一种方法，可以忽略背景荧光，并专注于检测实际细胞，真正的实验结果可以看到。

图2。基于图像和细胞的迁移分析。细胞计数(A-B)和荧光信号(C-D)来自动力学4倍蒙太奇图像。

细胞侵袭分析

以10%的血清作为化学引诱剂对照，进行动力学成像以确认MDA-MB-231细胞²的侵袭能力。

图3。MDA-MB-231细胞入侵的4倍蒙太奇图像。RFP表达MDA-MB-231细胞在10%或0%血清作用下侵袭的动态图像。使用RFP成像滤波器立方体和4倍物镜捕获的图像。

使用Gen5和表2中先前描述的参数来确定入侵细胞的数量。再次测定每组采集图像的总荧光。

图4。基于图像和细胞的入侵分析．细胞计数(A-B)和荧光信号(C-D)来自动力学4倍蒙太奇图像。

MDA-MB-231细胞对10%血清趋化剂的侵袭反应遵循与之前MCF-7细胞迁移相同的基本模式(图4A)。然而，在阴性对照孔中通过基质侵入的细胞数量在整个潜伏期内保持较低。这使得细胞比率在整个潜伏期内急剧增加(图4B)。荧光信号分析结果表明，阳性和阴性对照井的RFU值在整个潜伏期以缓慢、稳定的速度增加。最终结果是RFU比率保持在较低水平，仅达到1.4的最大值。这些发现可能再次导致对被测试的细胞系或化学引诱剂做出错误的假设。

荧光蛋白与荧光标记信号的分析比较

并不是所有用于细胞迁移或侵袭研究的细胞都会构成表达荧光蛋白。因此，有必要演示使用来自其他手段的荧光信号使用相同成像和分析步骤的能力。细胞追踪绿色染料通常用于细胞健康和运动的长期调查。因此，它是理想的用于细胞迁移和侵袭试验。使用GFP成像立方体捕获绿色荧光信号(图5)。

图5。CellTracker Green标记MDA-MB-231细胞入侵。MDA-MB-231细胞的动力学图像，在用CellTracker Green CMFDA染料进行实验前进行标记。10或0%血清作为阳性和阴性化学引诱剂对照。使用GFP成像滤波器立方体和4倍物镜捕获的图像。

使用Gen5软件和表1中先前描述的参数再次量化入侵细胞数量。阳性/阴性细胞比率由细胞追踪器染料的荧光信号计数的入侵细胞数计算。然后将CellTracker分析的结果与先前使用RFP信号生成的结果进行比较。

图6．荧光信号分析比较。使用RFP或CellTracker Green信号从阳性和阴性对照孔中计数的细胞比例。

从图6的结果中可以明显看出，与使用由组成表达的荧光蛋白生成的值相比，使用来自荧光细胞标签的信号并没有看到数据质量的损失。因此，两者都适合于量化迁移或入侵细胞的数量。

细胞入侵百分比分析

量化细胞入侵是另一个重要因素在体外了解转移性肿瘤细胞模型对试验药剂反应的机制。³计算公式如下:

(RFU_我——RFU_b) / (RFU_米——RFU_b) × 100

这里RFU_我表示细胞通过基膜入侵时的荧光，RFUm表示细胞通过未涂膜时的荧光，RFU表示细胞通过未涂膜时的荧光_b表示背景荧光值。对于这里显示的结果，来自迁移和入侵MDA-MB-231细胞产生的RFP数据，背景荧光表示每个实验在孵育时间=0小时计算的RFU值。

图7．细胞入侵率测定。RFU (a)和细胞计数(b)值，除了细胞侵袭率计算，由迁移和侵袭性RFP表达的MDA-MB-231细胞对10%血清的反应确定。

在图7A中，由于红色荧光蛋白的荧光通常比其他绿色位移蛋白的荧光弱，因此使用这种分析方法可以看到微弱的原始荧光和∆RFU值。这可能会潜在地影响最终的入侵百分比。当将细胞计数代入相同的公式(图7B)时，很明显计算出的入侵率较低，这可能更能反映实际的体内结果。

结论

康宁FluoroBlok细胞培养插入物是一种易于使用、健壮、具有代表性的方法，可用于确定癌细胞的迁移和侵袭特性。由于该仪器能够自动聚焦到细胞层，因此该平板的插入设计和集成的荧光阻断膜使其非常适合与安捷伦BioTek Cytation 3细胞成像多模式阅读器一起使用。2022世界杯附加赛决赛结合温度和气体控制以及使用亮场成像进行聚焦，可以进行较长期的实验，以确定所检查的细胞类型和化学引诱剂的适当培养时间。最后，Agilent BioTek Gen5数据分析软件的细胞分析能力允许确定实际迁移或入侵细胞的数量2022世界杯附加赛决赛，这可以从这些重要的实验中收集更准确的信息。

参考文献

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3. 鹧鸪,j .;体外氟块肿瘤侵袭试验。木星。2009年,29岁。http://www.jove.com/ details.php吗?Id =1475, doi: 10.3791/1475。