一种新型彗星检测的自动化成像和分析，以实现高通量基因毒性检测

作者: Brad Larson，安捷伦科技有限公司；克莱尔·惠特克和桑德拉·伍德盖特，Trevigen公司。

简介

人类接触基因毒素是不可避免的，因为环境中存在对DNA有害的物质，也是人类细胞代谢的结果，它们可导致细胞死亡、基因突变，甚至癌症、疾病和衰老。^{1 - 4}与此同时，化疗和放疗等治疗方法依赖于肿瘤细胞基因毒性的启动来产生积极的治疗结果。⁵有效、精确地修复受损DNA的能力取决于细胞DNA的修复能力。因此，量化DNA损伤并准确测量修复的速率和程度在流行病学、毒理学和药物开发等应用中至关重要。

彗星实验已经很好地用于量化哺乳动物细胞中的DNA损伤，并与广泛的DNA损伤剂的检测兼容。事实上，它可以用来监测几种不同DNA修复途径的细胞DNA修复能力。该实验的原理是电泳凝胶中DNA碎片的迁移，通过荧光染色和显微镜观察，完整的DNA(彗星头)比碎片DNA(彗星尾)的移动速度要慢。⁶彗星尾部DNA碎片的百分比是DNA损伤的直接衡量标准。

彗星分析通常是手动执行和分析的，因此尽管该分析提供了更高的灵敏度，但作为一种可靠的方法，采用速度很慢。本应用笔记演示了生成自动化的、高通量的基于彗星的基因毒性数据的组合过程。高密度载玻片可以同时比较96个单独的样品。染色后，每个孔的自动成像和分析使用一种新颖的细胞成像多模式阅读器，并进行普遍接受的计算;比如尾巴中DNA的百分比。新型单细胞微阵列彗星检测格式的结合，^7、8以及自动化仪器和分析，提供了一种准确、可靠的方法来评估哺乳动物细胞中的DNA损伤和DNA修复。

材料与方法

材料

分析和实验组件

碱性CometAssay Control Cells(部件号4256 - 010 - CC)， LMAgarose(部件号4250- 050-02)，2孔CometSlides(部件号4250-004-03)，3孔FLARE Slides(部件号3950-075-02)，96孔CometSlides(部件号4253-096-03)，Lysis Buffer(部件号4250- 050-01)，和CometAssay电泳系统(部件号4250-050- es)由Trevigen, Inc. (Gaithersburg, MD)捐赠。96-Well CometChip(零件号4260-096-01)和SYBR金核酸凝胶染色剂(零件号S-11494, ThermoFisher, Carlsbad, CA)，稀释到1倍，也由Trevigen, Inc.提供。

96井CometChip系统

Trevigen公司的96孔CometChip系统(部件号4260-096-CS)使用彗星试验在一张载玻片上同时处理和测量一种或多种细胞类型的DNA损伤。它由载体底座、宏孔器、盖子和钥匙组成，适用于组织培养培养箱。将CometChip插入到载体底座中，当宏井形成器被磁性吸附到底座上时，就会在CometChip上形成96个密封的宏井。一旦处理完成，执行标准的碱性彗星试验，导致每个大孔的高密度不重叠细胞。

2022世界杯附加赛决赛Agilent BioTek Cytation 5细胞成像多模式阅读器

安捷伦B2022世界杯附加赛决赛ioTek Cytation 5是一种模块化的多模式微生物板阅读器，结合了自动化数字显微镜。可使用基于滤镜和单色仪的微孔板读数，显微镜模块提供高达60倍的荧光放大倍数，亮场，彩色亮场和相位对比度。特别强调活细胞分析，Cytation 5功能温度控制到65°C, CO₂/ O₂气体控制，双注射器动力学分析。该仪器使用GFP成像通道对载玻片和CometChip上的染色DNA进行成像。2井和3井的CometSlide使用了一个滑动适配器(零件号1220548)，96井的CometSlide和CometChip成像时使用了一个两部分的适配器(零件号1322144)，以确保定位一致。

2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek Gen5数据分析软件

集成的Gen5软件控制Cytation 5自动数字显微镜和基于pmt的微板阅读。图像采集是完全自动化的，包括样本平移、对焦和曝光控制。细胞分析可以独立分析整个彗星和彗星头。

方法

标准碱性彗星试验

幻灯片如下所示或直接从Trevigen获得。标准的碱性彗星测定程序使用碱性彗星测定对照细胞(CC)进行，用不断增加的专用浓度的依托泊苷进行处理，这些依托泊苷嵌入低熔点琼脂糖中，并固定在2孔、3孔和96孔经过特殊处理的载玻片上，以促进粘附。将载玻片在裂解缓冲液中浸泡30- 60分钟，在4°C下去除DNA中的膜和组蛋白，然后在pH值13的碱性电泳缓冲液中室温平衡30分钟，使DNA展开并变性。使用CometAssay电泳系统，在4°C, 1v /cm的条件下进行碱性电泳30 ~ 45分钟。将载玻片中和，琼脂糖干燥，然后用SYBR Gold染色DNA。干燥图像使用Loats自动彗星分析评分系统(Loats Associates, Inc.， Westminster, MD)在10倍放大倍率下进行分析，并与Agilent BioTek Cytation 5和集成Agilent BioTek Gen5数据分析软件获得的图像进行比较。2022世界杯附加赛决赛

使用CometChip进行碱性彗星检测

将完全培养基中培养的淋巴细胞添加到每个CometChip孔中，并通过重力捕获到30 μ m的琼脂糖微孔中。多余的细胞被抽吸，留下一组不重叠的细胞。多个实验条件并行进行，在完全培养基中添加不断增加的依托泊苷浓度(类似于碱性对照细胞)，并在组织培养箱中处理30分钟。一旦处理介质被吸入，CometChip从盒中取出，用磷酸盐缓冲盐水冲洗，覆盖5 mL低熔点琼脂糖，然后使用标准的碱性彗星条件进行处理。CometChip在4°C溶解缓冲液中浸泡60分钟，然后在pH 13碱性电泳缓冲液中浸泡40分钟，平衡温度为4°C。使用CometAssay电泳系统，在4°C、1 V/cm的条件下进行55分钟的碱性电泳。CometChip中和后，用SYBR Gold染色DNA。由于96孔的CometChip含有湿琼脂糖凝胶，因此当将CometChip置于两部分适配器时，凝胶面朝上。与使用CometSlide获得的彗星相比，这些成像的彗星出现在镜像配置中，然而，这并不影响分析。使用Agilent BioTek Cytation 5和Agilent BioTek 2022世界杯附加赛决赛Gen5数据分析软件获取和分析湿井图像，并与使用ImageJ开源软件分析的4x tiff湿井图像数据进行比较，使用OpenComet插件(www.cometbio.org）.

结果与讨论

2井和3井CometSlide成像

精确的自动彗星成像首先使用含有已知DNA损伤水平的CometAssay碱性对照细胞进行验证，在2孔和3孔CometSlide幻灯片格式上使用标准的碱性彗星检测进行处理。所有滑动井都使用之前确定的偏移量自动成像，无需手动确定滑动井的位置。由于载玻片上的琼脂糖已事先干燥，在典型的载玻片配置中，染色后将载玻片放置在载玻片适配器中，染色孔朝下。使用4 × 3图像蒙太奇，从载玻片的每个井中捕获了8,165 × 7,956 μ m的区域(图1)，产生了典型的每井400至500颗彗星的数量。

图1所示。成像。使用低温保存的碱性彗星测定法控制细胞群CC0(健康对照组群体)和CC3(高依托泊酚浓度处理的健康对照组群体)从单孔拼接染色彗星的4 × 3蒙太奇图像。

曝光参数的设置使每个像素的荧光值在CCD相机的可量化范围内。还对蒙太奇中的所有单独图像进行了自动对焦(图2)。

图2。三井CometSlide 2.5倍图像。从碱性CometAssay控制细胞群的单个孔中捕获的图像，显示高于正常水平(CC0)的高(CC3)、中(CC2)、低(CC1)或没有明显的DNA损伤。

这种组合可以准确地捕捉到没有DNA损伤的彗星的信号，荧光只从彗星头部发出(如图2 CC0所示)，也可以准确地捕捉到DNA损伤严重的彗星的信号，荧光分布在彗星头部和彗尾之间(如图2 CC3所示)。

尾巴计算中DNA百分比

成像完成后，使用Gen5数据分析软件进行细胞分析。进行了两项单独的分析，以确定常用的彗星测定值，即“尾部DNA百分比”。这个数值考虑了当DNA被测试剂破坏时彗星圆度的变化。彗星中未受损的DNA长度保持一致。因此在电泳过程中，几乎看不到迁移，彗星呈现为一个高圆度的绿点(图2 CC0)。相比之下，高度受损的DNA由不同长度的片段组成，此外还有一部分仍未受损。在电泳之后，与其他核酸凝胶一样，较小的片段比由更多碱基对组成的片段迁移得更远，形成了典型的彗星形状。彗星现在由两部分组成，彗头包含未受损的DNA，彗尾由测试剂的破坏活动产生的较小片段组成(图2 CC3)。这两部分的圆度，当作为一个对象分析时，作为彗星尾巴程度的函数而降低，并通过代理，遗传毒性水平。

细胞分析的第一步确定了整个彗星的圆度。主要和高级标准(表1)被设置为自动在每颗彗星周围放置物体面具，尽管遗传毒性水平(图3)。

然后，附加的子种群标准应用于使用表1中的参数识别的原始天体，以确保在最终计算中只使用真正的单一彗星。在标准的碱性彗星分析过程中，彗核可能会彼此靠近，或者重叠，导致多颗彗星被识别为一个单一物体(图3,CC2和CC3所见)。

然而，这些天体表现出与普通彗星不同的标准，例如更宽的信号变化，更大的总信号和更大的尺寸。因此，通过设置适当的标准差、积分和尺寸子种群参数，将含有多颗彗星的天体从最终分析中剔除。相比之下，物体掩模也可以放置在井中的物体周围，如细胞碎片、棉绒和其他异常物。这些项目通常表现出一致的高或低信号，变化很小。通过添加最终的子总体度量来确保对象包含一定程度的信号变化，这些虚假对象也被丢弃。最终纳入的对象产生的结果具有高度的准确性和一致性。

表1。2022世界杯附加赛决赛Agilent BioTek Gen5全彗星细胞分析参数。

图3。总的彗星主要细胞分析对象面具。使用Agilent BioTek Gen5主要细胞分析参数自动放置在来自所有对照细胞群的彗星周围的对象掩模(上图所示的代表性CC3图像)。2022世界杯附加赛决赛红色高亮的对象使用子种群标准被淘汰，而金色高亮的项目被包括在最终计算中。

第二单元分析步骤确定彗星头的圆度。对初级和高级标准(表2)进行了修改，使物体掩模仅放置在彗星头部周围，其中包含最高的荧光信号。额外的子种群指标再次被用于消除非彗星物体。

利用从整个彗星和彗头分析中产生的最终圆度数据，确定了彗尾DNA的百分比。Gen5使用以下公式自动计算最终值:

[1-(彗星总圆度/彗星头圆度)]x100

公式中包含的分数表示从整个彗星到彗星头的圆度变化，或者是彗星头中DNA的分数部分。因此，1减去确定的部分就代表了彗星尾部的DNA部分。当乘以100时，彗星尾巴中最后的DNA百分比就被揭示出来了。重复2孔和3孔载玻片，分别使用4个碱性CometAssay对照细胞群(CC0至CC3)，计算尾部DNA的百分比。

如表3所示，随着健康人群(CC0)依托泊苷处理(CC1到CC3)的增加，2井和3井CometSlides尾部计算的DNA百分比相应增加。将这些值与之前使用普遍接受的彗星分析方法从相同玻片生成的值进行比较，确认Agilent BioTek Cytation 5和Agilent BioTek Gen5使用的自动化成像和分析方法为彗星分析玻片提供了准确的结果。2022世界杯附加赛决赛

表3。使用标准碱性彗星试验中的CometAssay对照细胞对2孔和3孔CometSlides进行尾分析的DNA百分比。

彗星尾矩计算

除了尾矩计算中的DNA百分比，彗星评估中最被接受的方法之一是彗星尾矩，或称尾矩。该方法9结合了彗星(细胞)头、尾(图4)和尾值中DNA百分比的测量结果。

图4。彗星尾矩计算中包含彗星面积。

在第5代总彗星和彗星头分析中，除了物体的圆度外，还进行了物体大小的计算。然后将这些值合并到下面的公式中来计算彗星尾矩:

{ds3 × [((ds1 - ds2)/2) + (ds2 /2)]}/100

其中DS1为彗星总长度;DS2为彗星头长;DS3是DNA在尾值中的百分比。彗星尾巴长度的一半，或者彗星总长度减去彗星头长度，加到彗星头长度的一半。这个总数乘以DNA在尾值中的百分比，再除以100，以去除表达的百分比。因此，显示出很少或没有DNA损伤的彗星的尾矩值接近于零。随着DNA损伤的增加，尾矩也相应增加。

比较了使用Agilent BioTek Gen5和Loats分析软件计算的彗星尾矩值，该软件以前用于尾检测中的DNA百分比(表4)。2022世界杯附加赛决赛

表4。2井和3井彗星滑动的彗星尾矩计算。

表4中所示值的相似性证实了Gen5图像分析也可以用于计算常用的彗星尾矩值，除了尾DNA百分比。

CometSlide拥有96口井，其主要优势在于能够以高通量格式分析大量样本。每口井的自动成像都是通过单个成像读取步骤完成的。采用自动对焦，曝光设置如前所述，用于2孔和3孔切片成像。成像和分析程序的验证使用96孔CometSlide和碱性CometAssay对照细胞，每个对照细胞群有12个重复孔。每张2.5倍安捷伦BioTek Cytation 5图像中平均捕获了30到40颗彗星，Loats分析软件在10倍放2022世界杯附加赛决赛大下捕获了大约40颗彗星(数据未显示)。使用Agilent BioTek Gen5进行分析(数据未显示)，参数详见表1和表2。2022世界杯附加赛决赛

结果再次与之前使用相同幻灯片和Loats分析软件生成的数据进行比较。图5说明了如何将尾巴和彗星尾时刻值中的DNA百分比与其他分析包进行比较，并通过使用组合过程生成的复制进行比较，从而节省了通常用于执行手动成像和彗星评估的时间。

图5。(A)尾计算中的DNA百分比和(B) 96孔CometSlide的尾矩，使用标准彗星试验中的碱性CometAssay控制细胞。

96井CometChip成像和分析

96孔CometChip系统显著改善了96孔CometSlide所提供的高通量格式，提供了一种同时治疗和测量由不同处理引起的DNA损伤的方法，或在单个载玻片上的不同细胞类型之间。CometChip的琼脂糖图案使彗星均匀分布在整个井中，提高了分析程序的简单性和准确性。自动化成像再次使用96井适配器进行，方法与96井CometSlide类似。使用96孔CometChip格式，将健康的淋巴细胞(TO)捕获到微孔中，并用增加依托泊苷浓度(T1至T3)的24个复制孔进行处理。通过类似于96井CometSlide程序的碱性彗星分析对CometChip进行处理后，它被用于验证成像和分析。每张2.5倍的图像捕捉到100到120颗彗星(图6)。

图6．96井CometChip成像。使用2.5倍物镜在高(T3)、中(T2)、低(T1)或没有依托泊苷处理(T0)的井中拍摄图像。

图6表明，微孔消除了彗星放置的随机性，简化了分析，并减少了在执行最终计算之前需要移除的物体数量(图7)。

图7。96井CometChip全彗星和彗星头分析。使用表1和表2分析参数，从T3或T0依托泊苷处理中自动绘制彗星周围的物体掩模。最后的计算中，红色高亮的对象被排除，金色高亮的对象被包括在内。

尾值的最终DNA百分比再次与之前从同一幻灯片生成的数据进行比较，表明当与高通量CometChip系统一起使用时，安捷伦BioTek Cytation 5和Agilent BioTek Gen5分析提供了可靠、准确的结果。2022世界杯附加赛决赛

表5所示。96口井CometChip尾部计算的DNA百分比。

结论

碱性彗星试验是一种进行基因毒性测量的可靠方法，加上96孔CometSlide和CometChip，可以以高通量格式对大量样本进行高效分析。通过添加安捷伦BioTek Cytation 52022世界杯附加赛决赛细胞成像多模式读取器，可以快速执行自动彗星成像，并具有高清晰度，以检测彗星尾部荧光的微小增加。单个或图像蒙太奇捕捉允许自动化程序与所有幻灯片和CometChip配置执行。最后，使用安捷伦BioTek Gen5数据分析软件进行的彗星分析允许立即自动确定2022世界杯附加赛决赛尾巴DNA百分比和尾矩等基本计算，从而消除最终报告数据的人工主观性和可变性。检测系统、自动成像和分析方法的结合创建了一种易于使用、可靠的方法来对重要的测试分子进行基因毒性测量。

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