自动化，高通量，基于htrf的组蛋白甲基转移酶和去甲基酶活性检测

作者: Brad Larson和Peter Banks，应用部门，BioTek Instruments, Inc, Winooski, VT;尼古拉斯·皮埃尔，托马斯·鲁，苏珊娜·格雷厄姆François德戈尔，Cisbio美国公司马萨诸塞州贝德福德

简介

表观遗传学是研究在染色质水平上影响DNA转录状态的修饰。表观遗传学领域包括对改变的研究，如乙酰化和去乙酰化，甲基化和去甲基化，泛素化和转录中涉及的各种底物的磷酸化。许多修饰发生在组蛋白n端，或组蛋白尾部，并影响DNA序列那部分的基因表达。这些变化是细胞胚胎从最初的全能状态分化的一个正常的、必要的部分，然而，异常的变化与自身免疫性疾病、糖尿病和许多人类癌症有关¹．

基于表观遗传学的药物开发主要集中在组蛋白乙酰转移酶(HATs)和组蛋白去乙酰酶(HDACs)。然而，最近的研究表明，组蛋白甲基化也是动态的。它的一侧主要由赖氨酸特异性set结构域蛋白甲基转移酶家族控制，另一侧则由赖氨酸特异性去甲基化酶1 (LSD1)和含JmjC结构域的组蛋白去甲基化酶(JHDM)等去甲基化酶控制。这些相反的过程是另一个重要的基因转录调节因子。例如，异常的组蛋白甲基化模式，如高甲基化和低甲基化，通过多种机制与人类恶性肿瘤相关，包括非计划基因沉默。目前，许多药物发现项目都集中在甲基转移酶和去甲基酶类上，一些有前景的新抑制剂目前正处于临床前研究阶段²．因此，对于检测技术来说，允许以高通量形式轻松评估新的潜在组蛋白甲基化调节剂是至关重要的。

在这里，我们描述了来自Cisbio Bioassays (Bedford, MA)的两种均相时间分辨荧光(HTRF®)检测格式，以评估甲基转移酶和去甲基酶的小分子抑制剂能力。自动化分析程序采用高通量液体处理和检测仪器进行。

优化、验证和筛选数据证实，自动化流程以简单而可靠的方式提供了准确的结果。

HTRF生化表观遗传检测原理

HTRF检测原理依赖于对底物甲基化状态特异性的隐酸铕标记抗体和链霉亲和素受体分子。在这里使用的HTRF测定中，甲基转移酶测定(图1A)检测了SET家族的SET7/9孤儿基因在赖氨酸4残基上生物素化组蛋白H3的单甲基化。抑制剂、SET7/9酶、S-(5′-腺苷)- l -甲硫氨酸氯二盐酸盐(SAM)和生物素化非甲基化H3(1-21)肽底物混合物结合。SET7/9酶将H3(1-21)me0肽转化为H3K4me1肽。

去甲基化酶测定(图1B)通过JMJD2A酶对组蛋白H3赖氨酸36残基进行去甲基化。抑制剂、JMJD2A酶、α-酮戊二酸和生物素化三甲基化H3(21-44)肽底物混合物结合。JMJD2A酶将H3K36(21-44)me3肽转化为H3K36me2肽。

当底物产物与隐酸铕标记的针对甲基化位点乐鱼平台入口的抗组蛋白H3抗体孵育时，结合发生。在检测步骤中添加链亲和素- XL665 (SA-XL)后，近距离允许能量从铕供体转移到链亲和素受体，称为时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)。

图1所示。HTRF®生化表观遗传分析原理(A)甲基转移酶和(B)去甲基酶格式。

材料与方法

材料

试剂和化合物

H3K4me1-Eu(K)抗体(目录号61KA1KAE)、H3K36me2-Eu(K)抗体(目录号61KD2KAE)、链霉亲和素XL-665(目录号610SAXLA)和检测缓冲液(目录号62SDBRDF)均购自Cisbio Bioassays。43复合Screen-Well®表观遗传学库，版本1.0(目录编号:;BML-2836)由恩佐生命科学(普利茅斯会议，宾夕法尼亚州)慷慨捐赠。已知抑制剂(+)-JQ1(目录号92-1149)由DiscoveRx公司(Fremont, CA)捐赠。sininefungin(目录编号:2,4-吡啶二羧酸(2,4- pdca)一水合物(目录编号:S8559)P63395)、六水合硫酸铁(II)铵(目录编号:l -抗坏血酸(目录编号:F3754);A5960)， α-酮戊二酸二钠盐水合物和S-(5′-腺苷)- l -甲硫氨酸氯盐酸盐购自Sigma-Aldrich公司(圣路易斯，密苏里州)。UNC 0646(目录号4342)和UNC 0638(目录号4343)从研发系统公司(明尼阿波利斯，明尼苏达州)购买。 H3K36(21-44)me3 substrate and H3(1-21)me0 substrate were purchased from AnaSpec, Inc., (Fremont, CA). JMJD2A (Catalog No. 50123) and SET7/9 (Catalog No. 51010) were procured from BPS Bioscience, Inc., (San Diego, CA).

仪表

MultiFlo™微板分配器

MultiFlo™Microplate Dispenser (BioTek Instruments, Inc.)通过其两个蠕动泵和两个注射泵提供快速，准确的平板分配功能，容量范围从0.5-3000 μL。使用MultiFlo将酶、底物混合物、辅因子和抗体混合物以低至2 μL的体积分配。

Synergy™Neo HTS多模式微板阅读器

协同™NeoHTS多模式微板阅读器(BioTek Instruments, Inc.)具有专利的混合技术™，将基于过滤器和基于单色仪的检测系统结合在一个单元中。该阅读器通过HTRF认证，使用基于过滤器的系统，高性能氙气闪光灯和双匹配光电倍增管(PMT)，同时检测检测化学物质中665 nm和620 nm荧光发射，设置如下:板移动后延迟:0 msec;激发后延迟:150 μsec;集成时间:500 μsec;读数高度:8.5mm。

方法

F(%)计算

Delta F(%)，或测定窗口，根据每个酶浓度和时间点的结果计算，使用以下公式:

((HTRF价值_(时间X)-HTRF价值₍₀₎) / HTRF价值₍₀₎)) * 100

酶浓度及反应时间优化

SET7/9滴定至5、10、20和40 nM, JMJD2A滴定至5、10和20 nM，所有浓度均受测定酶反应影响。剩余的反应成分过量。在每个时间点(0 ~ 120分钟)后，通过添加检测试剂停止反应。

衬底K_米决定

H3(1-21)me0肽被用来作为SET7/9酶的底物。H3(1-21)me0连续1:2稀释，从500 nM开始，用SAM浓度200-0.01 μM进行反应。用α -酮戊二酸作为JMJD2A酶的底物。α -酮戊二酸系列1:5稀释，从1600 μM开始，用H3K36(21-44) me3肽浓度在1200-0 nM范围内进行反应。

自动化检测流程

在SET7/9检测中，在微孔板的每孔中加入4 μL 2.5X化合物，然后加入2 μL 5X酶。在室温下预孵育5分钟。孵育后，每孔加入4 μL底物预混合液，室温孵育60分钟。在每个孔中加入10 μL检测混合物，最后在室温下孵育60分钟，然后在Synergy Neo上使用330 nm激发/620 nm发射和330 nm激发/665 nm发射匹配的双PMT技术进行读取。

按照JMJD2A法，在微孔板的每孔中加入2 μL 5X化合物，然后加入2 μL铁预混合物和2 μL 5X酶。在室温下预孵育5分钟。孵育后，每孔加入4 μL底物预混合液，室温孵育100分钟。然后在每个孔中加入10 μL检测混合物，在室温下最后孵育60分钟，然后使用上述激发和发射设置在Synergy Neo上读取。

自动化分析Z '因子验证

自动化SET7/9和JMJD2A检测流程分别以0 μM和100 μM浓度的辛尼菌素(SET7/9)或2,4- pdca (JMJD2A)作为阳性和阴性对照，在Z′因子实验中进行，以测量检测的鲁棒性。每种化合物浓度48个重复用于每次试验，在孵育期结束时通过添加检测混合物停止酶反应。在60分钟的室温孵育后，使用上述设置读取培养皿。

复合图书馆屏幕

48种化合物，包括43种Screen-Well表观遗传学库化合物，以及抑制剂sininefungin, 2,4 PDCA， (+)-JQ1, UNC 0646和UNC 0638，分别在适当的实验缓冲液中从原来的10 mM浓度稀释到最终的20 μM, 2 μM和200 nM的1倍浓度。使用SET7/9和JMJD2A检测每种化合物浓度，遵循上述自动化工作流程。

剂量反应

从100 μM 1X浓度开始，对化合物库屏幕上的每种命中化合物采用1:4连续滴定进行剂量反应试验。每个命中化合物都使用SET7/9和JMJD2A测试，遵循上述自动化工作流程。

结果

酶浓度及反应时间优化

计算了最佳酶浓度和反应时间，以最大限度地提高检测窗口，同时最大限度地降低试剂成本。图2A所示的结果表明，40 nM的SET7/9酶产生的Delta F(%)最高。此外，对于所有SET7/9浓度的测试，酶反应在60分钟后趋于平稳。后续实验均采用SET7/9 40 nM浓度，反应时间60分钟。图2B中的数据显示，10 nM的JMJD2A酶产生的Delta F(%)值最高。

这种酶反应比SET7/9反应需要更长的时间才能达到稳定状态，直到100分钟才达到稳定状态。后续实验均采用JMJD2A浓度10 nM，反应时间100 min。

图2。(A.)酶滴定及反应时间优化数据SET7/9及(b)JMJD2A。

衬底K_米决定

加入正确的底物浓度对确保正确的酶反应动力学至关重要。典型地，浓度在K或K附近_米值是可以接受的，因为较高的值可以导致测试化合物结果的右移，使它们看起来不如在体内的行为。K_米数值由绘制的数据确定，并使用Michaelis-Menten曲线拟合进行分析。图3A的结果表明，在不同SAM浓度的测试中，H3(1-21)me0肽Km值范围为11-22 nM。此外，1 μM SAM在K处的δ F(%)最高_米价值。后续所有SET7/9实验均采用H3(1-21) me0 20 nM浓度和1 μM SAM浓度。图3B数据显示，在H3K36(21-44)me3浓度下，α-酮戊二酸的Km值在8-31 μM范围内，300 nM的H3K36(21-44)me3在K浓度时产生的Delta F(%)最高_米价值。后续JMJD2A实验均采用α-酮戊二酸浓度为20 μM, H3K36(21-44)me3浓度为300 nM。

图3。衬底K_米(a)曲线H3(1-21)me0和(b) α-酮戊二酸。

自动化分析Z '因子验证

使用先前计算的优化反应条件，自动化SET7/9和JMJD2A分析程序在Z′-因子1实验中得到验证。Z′因子是测定稳健性的衡量标准，并考虑了阳性对照和阴性对照之间的信号差异以及重复之间的信号变异。使用0-1的刻度，大于或等于0.5的值表示优良的测定方法。根据图4数据，sininefungin的Z '因子计算为0.91,2,4- pdca为0.84，表明测定性能良好。然后使用自动化检测方法进行化合物文库筛选，以寻找潜在的SET7/9和JMJD2A酶抑制剂。

复合图书馆屏幕

使用SET7/9(图5A)或JMJD2A(图5B)检测43种化合物Screen-Well表观遗传学文库和5种已知抑制剂，以确定每种化合物对酶活性和适当测定功能的影响。每种化合物的抑制率在左y轴上，而无化合物阴性对照620 nm信号的百分比，用于检测过滤效应或化合物自发荧光导致假阳性或假阴性，在每个散点图的右y轴上。化合物在两个不同的测试浓度下表现出超过50%的抑制作用，或在单一浓度下表现出高度的抑制作用，对供体荧光团620 nm信号没有明显影响，被标记为命中，因此可能是真正的酶活性抑制剂。然后将这些命中包括在剂量反应测试中，以辨别其抑制特征。

图4。自动化的Z′因子结果(a)SET7/9及(b)JMJD2A测定方法，性能优良。

剂量反应

用SET7/9和JMJD2A测定从化合物库筛选的命中化合物的小分子选择性。使用SET7/9试验(图6A)和JMJD2A试验(图6C)测试的所有浓度的所有化合物的抑制百分比。此外，抑制曲线和IC₅₀计算真正的SET7/9甲基转移酶(图6B)和JMJD2A去甲基酶(图6D)酶抑制剂的值。SIRT激活剂Piceatannol和组蛋白乙酰转移酶抑制剂Butyrolactone3对SET7/9有抑制作用，而组蛋白去乙酰化酶抑制剂Suberoyl双羟肟酸和NSC-3852对JMJD2A有明显抑制作用。靶酶功能的相似性可以解释所见的抑制作用，进一步的研究可以揭示这些化合物的作用机制。sininefungin和2,4- pdca，已知的SET7/9和JMJD2A抑制剂分别表现出预期的抑制曲线和IC₅₀值，从而验证剂量反应试验。

图6。剂量反应试验显示(A) SET7/9和(C) JMJD2A测定的所有化合物和浓度的抑制百分率，以及(B) SET7/9甲基转移酶和(D) JMJD2A酶抑制剂的抑制曲线和IC50值。

结论

HTRF SET7/9甲基转移酶和JMJD2A去甲基酶测定为酶活性和抑制的评估提供了一种敏感、精确的生化格式。使用MultiFlo™的非接触式点胶功能，每个检测过程都可以在低容量384孔格式中轻松自动化，使用的容量低至2 μL。此外，Synergy™Neo微孔板阅读器的氙气激励和滤波器检测系统能够同时量化供体和受体荧光团发射的信号。筛选和剂量反应数据说明了每个自动化分析的易用性和准确性。最后，分析化学以及液体处理和检测仪器的结合，为分析这些重要的表观遗传靶点的调制创建了一个快速、可靠的解决方案。

参考文献

1. Santos-Rosa h;Caldas, C.染色质修饰酶，组蛋白密码和癌症。欧洲癌症杂志，2005年11月，41(16)，2381-2402。
2. 瓦格纳,t;新的赖氨酸甲基转移酶药物在癌症中的靶点。中国生物工程学报。2012年7月10日，30(7)，622-623。
3. 张,j .;钟,t;用于高通量筛选测定的评估和验证的简单统计参数。中华生物医学杂志，1999,4(2)，67-73。

确认

作者要感谢恩佐生命科学对Screen-Well表观遗传学图书馆的慷慨捐赠。

HTRF®是Cisbio Bioassays的注册商标。

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