2014年11月04日
作者:Brad Larson, Ellaine Abueg, Leonie Rieger, Peter Banks，安捷伦科技公司
简介
细胞计数是生命科学中最常见的实验室任务之一。它是常规细胞培养繁殖所必需的，并作为任何基于细胞的检测的起点。虽然有许多仪器可用于自动细胞计数，可重复使用的血细胞计仍然是廉价的选择工具。它与实验室的另一种常用工具一起使用，即明场光学显微镜，这样细胞就可以在方格网格上可视化和计数。图1展示了血细胞计的侧视图和俯视图，以及光学显微镜下计数网格的放大视图。
图1所示。在高倍镜下，血细胞计的顶部，侧面和网格区域。标记为1 mm2的区域1、2、3和4的规则间隔为250µm，而区域5的规则更紧密，为50µm。
标记为1至4的标尺区域用于计数直径为20至30 μ m或约为标尺间距十分之一的哺乳动物细胞。红细胞的大小大约是哺乳动物细胞的五分之一，因此区域5的规定间距更适合计数。计数过程有点主观，因为一些用户对如何计算网格上的单元格有不同的协议。
完整的条形网格区域由一个提供100 μ m垂直尺寸的覆盖物覆盖，这有助于将细胞大致保持在所使用的显微镜的景深内，并定义用于计数的正方形的体积。对于区域1到区域4，用于计数的16个正方形代表0.1 mm的体积3.，或104因此，知道在适当密度下培养的稀释因子，可以很容易地计算出原始培养的细胞密度。通常，一种排除染料，如台盼蓝被使用，这样活细胞可以从死亡细胞中区分出来，细胞计数只反映活细胞。
本应用笔记演示了如何使用配备了对比度增强技术的安捷伦BioTek细胞成像多模式阅读器自动化血细胞计细胞计数过程。2022世界杯附加赛决赛对于总细胞计数，细胞成像仪使用自动相位对比显微镜来计数视野中的细胞总数，这大约是总网格面积的2.9倍。这有助于改进相对于手动计数的计数统计信息。此外，细胞活力也可以通过使用自动彩色成像的色氨酸蓝染色细胞在同一视野。
材料与方法
材料
细胞
人类新生儿真皮成纤维细胞(零件号cAP - 0008RFP)购自Angio - Proteomie (Boston, MA, USA)。细胞在高级DMEM培养基(部件号12491 - 015)+胎牛血清(FBS)， 10%(部件号10437-028)和Pen-Strep-Glutamine，各1倍(部件号10378-016)，分别来自Life Technologies (Carlsbad, CA, USA)。MCF-7细胞(部件号92020424)购自Cell Biolabs, Inc. (San Diego, CA)。细胞在MEM alpha培养基(零件号12561-056)+胎牛血清(FBS)， 10%(零件号10437-028)，Pen-Strep, 1x(零件号15070 - 063)和人重组胰岛素，每个10µg/mL(零件号12585-014)中繁殖。HCT116细胞(部件号cc -247)购自ATCC (Manassas, VA)。细胞在McCoy 's 5A (Modified)培养基中培养，HEPES(零件号12330)+胎牛血清(FBS)， 10%(零件号10437-028)和Pen-Strep, 1x(零件号15070-063)。
试剂:台盼蓝，0.4%(零件号15250-061)从Life Technologies购买。
2022世界杯南美区预选赛 ：Cytation 5结合了自动化数字显微镜和传统的多模式微板检测，提供了丰富的表型细胞信息和基于良好的定量数据。特别强调活细胞分析，Cytation 5功能温度控制到65°C, CO2/ O2气体控制，双注射器动力学分析。使用相位对比和彩色亮场成像通道对图1所述血细胞计1至4区的活细胞和死细胞进行成像。
2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek Gen5数据分析软件：Gen5软件控制Cytation 5的操作，用于自动数字显微镜和基于pmt的微板阅读。细胞分析和亚群参数的添加允许自动化的总细胞，以及死细胞计数，除了活细胞/mL计算。
方法
自动血细胞仪相位对比和彩色明场成像
将细胞与台锥蓝混合，在室温下孵育5分钟，并以与手动细胞计数相同的方式添加到血细胞计中。为了本应用说明的目的，将50µL重悬细胞与30µL培养基和20µL台盼蓝混合。然后将血细胞计放置到一个适配器中，该适配器可以与Cytation 5一起使用。用户提示要求将细胞添加到台盼中时的稀释因子。如果没有进行稀释，则输入值“1”。
图2。2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek Gen5细胞稀释用户提示。提示符出现在实验开始之前。输入值“2”表示与台盼蓝混合时细胞被稀释为1:2。
自动数字明场成像无法提供准确的细胞计数对比度，因此使用自动相位对比和彩色明场成像通道，以及4倍物镜。加入了定制的图像蒙太奇读取步骤，以确保血细胞计两侧的四个16平方网格区域成像，与手动细胞计数与血细胞计的典型过程相匹配。
活/死细胞计算采用安捷伦BioTek Gen5数据分析软件2022世界杯附加赛决赛
使用Gen5软件对捕获的4倍相位对比和彩色亮场图像进行细胞分析。活细胞计数使用相位对比图像，台盼蓝染色死亡细胞计数使用彩色亮场图像。表1和表2描述了用于执行两次单元格计数的参数。
表1。4倍相位对比图像元胞分析参数。
表2．4倍彩色明场图像元胞分析参数。
从所有四张4倍相位对比图像中计数的活细胞数量被转换为从图像中包括的4个16平方网格中平均计数的细胞数量。由于4倍图像的面积为2,874,661 μ m2(图3)，一个16平方网格的面积为1,000,000µm2，活细胞计数值除以2.9，以保持结果与人工计数报告一致。然后进行额外的计算，以确定细胞溶液中的活细胞/mL。
图3．4倍血细胞计的亮场图像16平方网格和周围区域。
细胞存活率也可以用以下公式确定:
活细胞/mL和%细胞活力值由Gen5数据分析软件自动计算。
结果与讨论
用相位对比成像法测定活细胞
活的MCF-7细胞在血细胞计上观察时，呈现为具有大部分圆形形态的结构，这是因为它们是作为悬浮液添加的，并且没有附着在底面上。由于更紧凑，这些单元在相位上产生了相对均匀的变化，使它们在黑暗背景上呈现为明亮的白色物体(图4A)。Agilent BioTek Gen5细胞分析工具中的下限阈值可以2022世界杯附加赛决赛设置为适当的值，以正确识别细胞结构，同时忽略图像的其他区域，包括台虫蓝染色的死亡细胞。还可以优化最小和最大对象大小，以确保识别单个单元格(图4B)。然而，死细胞残余物和其他非细胞碎片也可以添加到计数区域。
这些物质通常没有相同的信号水平，也不像活细胞那样呈圆形。因此，两个额外的子种群参数应用于主要识别的对象(表1)。不满足圆度和最小平均相位对比度信号要求的项目然后从最终的活细胞测定中消除(图4C)。
图4。活MCF-7细胞数量的测定。(A)含有MCF-7细胞的4x相位对比图像。(B)使用主要细胞分析参数的总对象计数。(C)通过合并亚种群标准进行活细胞计数。包括用红色高亮显示的对象。
每张图像的活细胞总数将大于仅从16平方网格计数的数量，因为4倍视场定义的计数面积更大。这可以提供更准确的细胞计数，由于系统误差，例如当细胞被推出网格区域在移液期间的细胞悬浮液，创建一个不均匀的细胞分散。此外，计数更多的细胞提供了一个统计优势，减少随机错误的细胞计数。最后，自动化程序是对细胞计数的客观测量，而不是技术人员的主观评估。考虑到这些属性，自动单元格计数过程通常会提供相对于手动计数更准确的单元格计数。归一化到每个网格计数的细胞，由Gen5自动执行，创建一个数学上准确的最终活细胞/mL值。
Gen5使用表1中列出的参数生成的细胞计数数通过执行手动细胞计数进行验证(表3)。
表3。手动和Gen5 MCF-7细胞计数的比较。通过除以2.9，每4张4x图像的Gen5细胞计数归一化为每4个16平方网格的细胞计数。
人工细胞计数与使用Cytation 5和Gen5生成的细胞计数之间的差异为1.9%，即每4个16平方网格中约有3个细胞，证明了自动化方法的合法性。
用彩色亮场成像法测定死细胞
彩色亮场成像用于识别计数区域内的死亡细胞。台潘蓝染色的死细胞在使用相位对比成像通道时表现为暗区，在加入彩色亮场后表现为易于识别的蓝色物体(图5)。
图5．活的和死的MCF-7细胞的彩色亮场图像。台盼染色为蓝色，死细胞为红色椭圆形。
最后的彩色亮场图像表示使用红色、绿色和蓝色LED激发拍摄的重叠图像。当使用红色通道时，深色台锥蓝染色细胞的信号变化最大(图6A)。使用反向阈值测量，以便识别黑暗物体。最小和最大对象大小值再次确保识别单个对象。非细胞对象可以再次出现在图像中，并且偶尔可以使用主要的细胞分析参数来识别。此外，当使用彩色亮场时，蚀刻在血细胞计上的线条也会产生明亮的信号。这可以导致图像中包含紧密蚀刻线的部分也由于信号在小区域内的急剧变化而被识别出来(图6B)。细胞的圆形，以及从死亡细胞中看到的较低的平均信号，再次消除了非目标物体(图6C)。
图6。用红色亮场激发法测定死MCF-7细胞。(A) 4倍红色亮场图像。(B)使用主要细胞分析参数的总对象计数。(C)满足附加子种群标准的对象。包含的对象突出显示为白色椭圆形。
最终的死细胞计数，加上相衬活细胞计数，然后可以用来计算%细胞活力值，以确定细胞培养的活力。
非典型细胞类型的细胞计数优化
虽然许多细胞类型具有相似的大小和形态，但并不是每个细胞模型在血细胞检测仪上都是相同的。这将需要修改细胞分析参数，以确保正确的计数被执行。使用相位对比成像观察时，HCT116细胞的典型细胞直径小于10µm(图7A)。通过将最小和最大物体尺寸分别调整为5µm和20µm，可以识别单个细胞直径。细胞也通常表现为小块细胞。通过提高阈值信号，细胞之间信号的微小变化可以用来在单个细胞周围放置对象掩码，并提供更准确的细胞计数(图7B)。
图7。HCT116成像和活细胞分析。(A) HCT116细胞的4x相位对比图。(B)使用修改的主要细胞分析参数在细胞周围绘制对象蒙版。以红色突出显示的对象包括在最终活细胞计数中。
再次进行手工计数细胞与使用Cytation 5和Gen5计数细胞的比较(表4)。结果进一步验证了自动化细胞计数方法提供了各种细胞类型的准确数据。
原代成纤维细胞是一种较大的细胞类型，具有非圆形、细长的细胞形态。因此，使用较高的圆形度作为亚群体的圈定器可以从最终计数中消除实际的死亡细胞。通过将循环水平从>0.5降低到>0.1，除了保持之前使用的平均信号截止外，还可以再次确定适当的死细胞计数。
结论
使用血细胞计和台盼蓝进行活细胞和死细胞计数是许多基于细胞的实验的一个简单但非常重要的开始。细胞浓度的知识，以及在细胞悬液中的生存能力是正确播种和数据生成的关键。虽然在检查单个或少量培养时很容易手动执行该过程，但当需要对大量培养进行计数时，或如果计数是常规执行时，该过程很快就会变得繁琐。人工计数也受个体执行程序的偏差影响，因此添加到载玻片或微孔板的实际细胞可能因实验而异。通过使用Agilent BioTek Cytation 5的相位对比和彩色亮场成像，使用台潘蓝的血细胞计活/死细胞计数可以以自动化的方式完成，从而解放实验室人员执行其他2022世界杯附加赛决赛更重要的任务。使用安捷伦BioTek Gen5数据分析软件和针对单个2022世界杯附加赛决赛细胞类型优化的程序进行的细胞计数也确保了每次实验中纳入一致的数量，减少了计数中的系统和随机误差。