2016年7月7日
作者: Brad Larson，安捷伦科技公司;Asha Sinha和Sachin Katyal，曼尼托巴大学，温尼伯，马尼托巴，加拿大
简介
哺乳动物细胞的DNA损伤和改变是由于内部因素，如压力、环境、氧化和代谢，以及暴露于外部刺激，如化合物、紫外线和宇宙辐射。基因毒性研究旨在识别和理解DNA损伤和修复的机制，并寻求通路调节和失调的方法，以提高治疗的成功率。除了治疗意义之外，包括化妆品、食品和饮料、化工和采矿/石油/石油在内的许多行业都采用了基因毒性测试来表征其产品的安全性。乐鱼平台入口
彗星试验，或单细胞凝胶电泳(SCGE)，已被确定为遗传毒性研究中DNA损伤的直接测量方法。通常，中性彗星用于检测DNA双链断裂，而碱彗星用于检测更广泛的DNA损伤，包括DNA单链断裂和碱基位点。使用这种方法，暴露于测试化合物的细胞被嵌入琼脂糖，裂解以去除膜和组蛋白，用碱溶液处理以解开和变性DNA(在碱彗星的情况下)，并受到电场的影响，根据电荷与质量比的差异将DNA片段与完整的DNA分子分离。通过荧光染色和成像，结果看起来类似于彗星，DNA片段(彗星尾巴)通过凝胶基质迁移，而完整/未受损的DNA保持静止(彗星头)。通常产生的指标，如彗星尾部DNA碎片的百分比和尾矩，是治疗后细胞DNA损伤的直接衡量标准。
荧光显微镜是测量这些参数的标准方法。通常，检测需要操作员干预图像捕获和分析，这往往是一个缓慢的过程，限制了样品的吞吐量。此外，在分析过程中，操作员的主观性也会导致结果倾斜，因为只有满足个人标准的彗星才会被选择包含在数据集中。将自动图像采集和分析纳入分析工作流程有助于提高样品吞吐量、分析稳健性和准确性，同时还提高了实验室的整体效率。
在测量潜在的破坏或修复剂的效果时，以每颗彗星为基础生成数据的能力也是可取的。虽然彗星尾巴和尾矩数据中的平均DNA百分比可以评估在一张图像或一组图像中捕获的种群，但它不允许对单个彗星进行最有效的审查，以确定为什么在成像样本集中的特定水平上看到损害。结合计算与特定彗星相关的多个区域的结果的方法，可以提供总体和单个彗星数据，从而提供更完整的数据集。
本应用笔记演示了一种自动检测和分析高通量彗星基因毒性数据的方法。使用一种新型的细胞成像多模式阅读器和高密度载玻片，可以同时处理和分析96个单个样品。具有双掩码功能的高级分析软件将每颗彗星的头部和尾部信息链接起来，以便实时种群水平数据以及单个彗星数据可用于尾部DNA百分比和彗星尾矩计算。
材料与方法
材料
细胞
U251(人类胶质瘤)细胞(零件号09063001)购自Sigma-Aldrich(圣路易斯，密苏里州)。
分析和实验组件
LMAgarose(零件号4250-050-02)，96孔CometSlides(零件号4253-096-03)，裂解缓冲液(零件号4250-050-01)和CometAssay电泳系统(零件号4250-050-ES)来自Trevigen, Inc. (Gaithersburg, MD)。SYBR金核酸凝胶染色剂(零件号S-11494, ThermoFisher, Carlsbad, CA)，稀释至1倍，也由Trevigen, Inc.提供。已知拓扑异构酶-1抑制剂(细胞毒素)，喜树碱(零件号208925)购自EMD Millipore (Billerica, MA)。
2022世界杯附加赛决赛Agilent BioTek Cytation 5细胞成像多模式阅读器
2022世界杯附加赛决赛2022世界杯南美区预选赛 是一种模块化的多模式微孔板阅读器，结合自动化数字显微镜。过滤器和单色仪为基础的微孔板读数是可用的，以及基于激光的激励alpha分析。显微镜模块提供高达60倍的放大荧光，亮场，彩色亮场和相位对比。特别强调活细胞分析，Cytation 5具有震动，温度控制到65°C, CO2/ O2用于动力学分析的气体控制和双注射器。该仪器使用GFP成像通道对染色的DNA进行成像。整合安捷伦BioTek2022世界杯附加赛决赛Gen5微孔板阅读器和成像仪软件控制Cytation 5，也自动图像捕捉，分析和处理。在对96口井的CometSlide进行成像时，使用了一个由两部分组成的适配器(零件号1322144)，以确保定位的一致性。
方法
标准碱性彗星检测性能
用0 ~ 10 μ M的喜树碱浓度处理培养的U251细胞，将其嵌入1%的低熔点琼脂糖中，并固定在经过特殊处理的96孔载玻片上以促进粘附。然后将载玻片浸泡在裂解缓冲液中，在4°C下浸泡30- 60分钟，以去除DNA中的膜和组蛋白，然后在pH值13的碱性电泳缓冲液中室温平衡30分钟，以解开并变性DNA。使用CometAssay电泳系统，在4°C, 1v /cm的条件下进行碱性电泳30 ~ 45分钟。将载玻片中和，琼脂糖干燥，然后用SYBR Gold染色DNA。染色的切片用Cytation 5成像，参数如表1所示。
表1。自动彗星成像参数。
Gen5双掩模彗星分析
主要掩码元胞分析标准(表2)被应用于自动放置物体掩码在每个捕获图像的彗星头周围。Auto threshold被选中，滑块移动到-35的值。二级掩模细胞分析标准(表3)也应用于在整个彗星周围放置一个附加的掩模。
表2。彗星头分析参数。
表3。总的彗星分析参数。
结果与讨论
自动96孔彗星成像和预处理U251细胞暴露于不同浓度的喜树碱中，并使用96孔CometSlide格式进行处理。2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek Cytation 5使用之前确定的板布局中的井位自动成像CometSlide，从而消除了人工确定彗星位置。曝光参数设置使每个像素的荧光值在CCD相机的可量化范围内，同时进行自动对焦和图像蒙太奇创建。
在图像捕获之后，Gen5软件自动执行多个步骤，以适当地准备每张图像进行分析。这些步骤提高了从每个测试样本生成的数据的稳健性。第一步使用表4中的标准对图像进行处理以去除背景信号。选择滚动球直径为1500 μ m的值，以确保图像中有足够的区域被纳入背景信号与真实彗星信号的区分。由于来自彗星尾部的信号可能相对较弱，这取决于DNA损伤的程度，通过分析图像的较小部分来确定背景信号可能会扭曲结果，导致来自彗星尾部的信号被错误地移除。合并更大的直径创建预处理图像与减少背景，更准确地识别荧光信号从实际彗星，而不影响最终结果。
表4。图像预处理参数。
图1．通过预处理去除图像背景信号。放大2.5倍图片(A)之前;(B)或在表4预处理标准后应用安捷伦BioTek Gen5软件。2022世界杯附加赛决赛(A)和(B)中的插图图表示使用Gen5线分析工具获得的单个彗星上绿色荧光强度的横截面。被测量的彗星在插入图的右侧可见。所使用的线的长度由插入图的x轴表示。
在第二步中，Gen5自动将两张单独捕获的图像按原始配置拼接在一起，以便最终组合图像中的彗星位置与井中看到的位置相同。
图2。图像拼接。2.5x图像(A和B)个人图像蒙太奇瓷砖;(C)最终缝合图像使用Agilent BioTek Gen5软件。2022世界杯附加赛决赛
最终的图像准确地描绘了每个测试条件下DNA损伤的程度，其中未经处理的彗星(图3A)表现为明确的球体或彗星头，而那些经过喜树碱处理的彗星则表现为明显的彗星尾巴形式的渐进性DNA损伤(图3B和3C)。
图3。基于用户编程的细胞分析参数的自动彗星分析。使用2.5倍物镜拍摄的图像，1 × 2蒙太奇染色彗星图像，来自单孔，使用U251细胞暴露于(a) 0µM(未经处理)喜树碱;(B) 0.1µM喜树碱;(C) 10µM喜树碱，使用GFP成像通道去除荧光背景。
自动双掩模彗星分析
主要和次要细胞分析标准(表2和表3)应用于所有使用Cytation 5的集成Gen5微孔板阅读器和成像仪软件捕获的图像。初级元胞分析自动屏蔽每个彗星头(图4A)，而次级分析自动屏蔽每个彗星尾(图4B)。
图4。基于用户编程的细胞分析参数的自动10µM喜树碱处理彗星分析。初级和次级细胞分析对象掩模分别显示(A)彗星头和(B)彗星尾与彗星头的关系。使用2.5倍物镜、1 × 2图像蒙太奇和GFP成像通道捕获的图像。
通过使用初级细胞分析首先掩盖彗星头部，然后对彗星尾部进行二级掩盖，每颗彗星都被正确地连接起来;减少错误结果的发生。进一步的亚群体分析可以用于消除重叠彗星，异常和其他可能被主观方法忽略的虚假物体。最后一组纳入的天体产生的结果具有高度的准确性和一致性，并且允许对种群水平以及单个彗星进行分析。
单个彗星度量计算
一旦完成彗星分析程序和图像制备，立即使用Gen5微孔板阅读器和成像仪软件进行多项计算，包括基于单个彗星的常用分析指标。第一个指标是尾巴中DNA的百分比。这个值考虑了彗星头部内的总荧光，包含未受损的DNA;以及含有受损DNA片段的彗尾(图5)。如上所述，尺寸小于完整DNA链的DNA片段在凝胶基质中迁移更快。当荧光染色并作为一个物体进行分析时，彗星头部以外的荧光随着彗星尾部的范围而增加;以及DNA损伤的程度。Gen5微孔板读取器和成像仪软件使用以下公式和感兴趣的对象指标(表5)自动计算尾巴中DNA的百分比:
(1 - (m1/ M2) × 100
表5所示。尾巴中的DNA百分比公式量度。
当彗星头部荧光的分数，就彗星总荧光信号而言，减去1，彗星尾部的分数仍然存在。当乘以100时，这个值就代表了彗星尾巴中DNA的百分比。
第二个度量是彗星尾矩。在这里，之前计算的尾值中DNA的百分比与彗星头部和尾部的尺寸测量相结合(图5)。随着长度测量的集成，不仅考虑了受损DNA的总量，还考虑了DNA链损伤的程度。一条链被切割的次数越多，产生的碎片就越小。通过代理，碎片越小，在凝胶基质中的迁移就越远，从而产生更长的彗尾和更大的尾矩。
图5。尾矩计算中包含彗星区域。
Gen5微孔板读取器和成像仪软件使用以下公式和感兴趣的物体指标(表6)计算尾矩值:
{[(1 - (m .1/ M2× 100] × [((m .3./ M5)/2) + (((m .4米3.) /米5) / 2)]} / 100
表6所示。彗星尾矩公式度量。
公式的第一部分计算了前面提到的彗星尾巴中DNA的百分比。公式的第二部分计算了彗星头长度的一半，公式的最后部分计算了彗星尾长度的一半。通过将每个区域除以彗星头的大小，长度值可以用于最终的完整公式。随着DNA损伤的增加，彗星尾巴的长度和尾巴中DNA的百分比也会增加，从而在这三种现象之间产生直接关联。
通过将每个公式包含到细胞分析步骤的计算指标中，可以确定拍摄的每张图像中包含的每颗彗星的彗尾DNA百分比和尾矩(图6)。
图6。演示单个彗星测定度量计算的彗星测定图像的截图。
双掩模彗星试验验证数据
应用上述公式，生成了含有不同喜树碱处理水平井的彗星种群成像结果。如图7所示，彗星尾和尾矩值中的DNA百分比都开始较低，并随着喜树碱处理浓度的增加而适当增加，正如预期的那样。
图7．使用暴露于不同喜树碱浓度的U251细胞分析彗星尾和尾矩的DNA百分比。
每种化合物浓度测试4个重复。使用双掩模分析方法生成的数据也与之前验证的彗星分析方法进行了比较，该方法使用了基于彗星圆度的计算度量，随着DNA损伤的增加(图8)。
图8。使用双掩模或圆形分析方法比较彗星尾部和(B)尾矩值中产生的(A)百分比DNA。U251细胞暴露于不同浓度的喜树碱。每种化合物浓度测试4个重复。数据从www.aspinnursery.com/2022卡塔尔世界杯完整赛程resources/articles/novel-comet-assay.html．
两种方法对彗星尾和尾矩DNA百分比的结果一致，进一步验证了双掩模方法在单个彗星和种群基础上提供准确、可靠数据的能力。使用自动化方法，尾DNA百分比和彗星尾矩计算在多个重复中产生了一致的数据，同时减少了人工解释和错误来源，并节省了人工计算的时间。数据可以与来自其他分析包的数据进行比较，使用圆度彗星标准。
结论
与手动方法相比，以高通量格式执行稳健的碱性彗星分析减少了实验室工作流程的瓶颈。通过安捷伦BioTek Cytation 5细胞成像多模式阅读器实现自动2022世界杯附加赛决赛化彗星成像，进一步实现了高通量效率，快速成像和高清晰度，可检测彗星尾部荧光的微小变化。双掩蔽技术可以进行群体水平分析以及单颗彗星分析，而常见的计算，如尾部DNA百分比和彗星尾矩，可以自动和客观地实时确定，而不需要单独的软件，消除了分析中可能会扭曲结果的人为主观性和错误。在进行基因毒性研究时，将检测系统与自动化成像和分析相结合，创建了一种可靠的、用户友好的方法。