自动菌落形成分析

作者: Ernest Heimsath，博士，首席科学家，应用部门，BioTek仪器公司，维诺斯基，VT

摘要

菌落形成试验评估单个细胞的增殖能力。对于癌症药物筛选等应用，区分保留这种增殖能力的细胞和不保留这种增殖能力的细胞是很重要的。该方法的传统分析方法包括人工用肉眼对多井格式的每口井中的菌落进行评分和量化，这限制了其吞吐量能力。我们提出了一种自动化方法，用于在6孔和96孔微孔板中进行菌落形成分析，使用垂直彩色亮场成像能力2022年世界杯抽签 细胞成像多模式阅读器与广泛的视野。

简介

菌落形成试验是癌症研究的基本方法，可以进行药物筛选和放射给药^{(1 - 5)}．该试验通过以足够低的密度播种细胞来进行，这样单个细胞可以繁殖到足够的菌落区域，而不会撞击邻近的菌落(图1)。^(6、7)．在设定的时间点，粘附菌落被固定，然后用水晶紫比色染料染色，这允许对培养容器进行视觉检查，并量化扩展的菌落数量。这种方法的一个主要缺点是对菌落进行评分通常是由训练有素的技术人员手动进行的。这种分析方法既劳动密集型，又妨碍了使用大于12孔或24孔板的格式以高通量方式进行这种分析的能力。此外，虽然公认的蜂群组成标准是50个以上的细胞，但分配蜂群大小的定量方法并不经常被遵守，这使得手工评估的蜂群大小的界限是主观的。

在本应用笔记中，我们提出了一种自动化和高通量的方法，用于在96孔微孔板中使用直立明场显微镜进行菌落形成分析。晶体紫的荧光特性首先用于定义集落面积，而Hoechst 33342用于量化集落内的细胞数量。使用Cytation 7细胞成像多模式阅读器的定量显微镜可以实现自动化的工作流程，以捕捉整个孔图像，然后在大规模格式上识别、量化和描述菌落。这种方法能够收集更可靠的统计样本集，无论是在重复方面，还是在更广泛的药物剂量范围内。

图1所示。菌落形成实验示意图。悬浮细胞在组织培养孔中以足够低的密度播种，以使单细胞增殖成克隆群体。抗增殖化合物的效力可以根据相对于对照的存活菌落数量来评估。

材料与方法

试剂

多柔比星(50 mM DMSO)购自Tocaris (Cat #2252)。PBS由溶解在1片/200毫升去离子H中的片剂(Sigma P4417)制成₂O (dH₂以Sigma P6148粉末为原料，在PBS中加热至60°C，持续搅拌1小时或至完全溶解，溶液澄清，然后通过0.45 μm过滤器澄清，制备4%多聚甲醛。从ThermoFisher(62249)购买Hoechst 33342溶液(20 mM)，然后用去离子H进一步稀释到10 mM的原液₂O.晶紫(CV)购自Sigma (V5265)，为25 mM (1% w/v)水溶液。

细胞培养

HeLa (ATCC CCL-2)和co2 (ATCC HTB-37)细胞在37°C的高级Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium (Gibco #12491)中与10% FBS (Gibco #10437)和1倍青霉素/链霉素/ l -谷氨酰胺(Gibco #10378)中培养。

菌落形成分析

菌落形成分析采用两种格式进行:6孔培养板(Costar #3516)和96孔扁平透明底黑色微板(Costar #3904)，初始播种密度分别为200个细胞/孔和50个细胞/孔。初始播种时，T75烧瓶中培养的细胞用TrypLE (Gibco #12605)传代，然后转移到15 mL锥形管中，300 G离心5分钟，然后在10 mL新鲜培养基中重新悬浮。用血细胞计测定细胞浓度。对于96孔微孔板，将细胞稀释至5.0 × 102细胞/mL，然后将100 uL滴入含有100 μL培养基+ 20 μL 11x阿霉素的孔中。对于6孔板，将细胞稀释至2.0 x 102细胞/mL，然后将1 mL分配到含有1ml + 0.2 mL 11x阿霉素的孔中(阿霉素制剂见下文)。为了避免来自快速变暖介质的对流，确保细胞在井底的均匀分布，将含有新鲜细胞的培养皿在25°C的清洁台面上孵育30分钟，然后返回37°C的培养箱。让单细胞集落扩张7天，然后用PBS冲洗2倍，并用4%多聚甲醛在PBS中固定10分钟。

药物治疗

11点阿霉素滴定建立如下。在Advanced DMEM中，将阿霉素从原液稀释至11 μM，或最高处理浓度(1000 nM)的11倍。从该11x原液中制备11倍稀释液，然后将20 μL加入最终体积为220 μL(96孔板)或将0.2 mL加入最终体积为2.2 mL(6孔板)的含有种子细胞的1倍最终浓度:1000,100,32,10,5.6,3.2,1.8,1,0.32,0.1和0.01 nM。对于96孔的模式，每种浓度按列设置8个重复，第12列包括本研究中使用的最高浓度(0.2% v/v)的车辆对照(DMSO)。对于6孔格式，浓度设置为6个板上的三份。电子商务₅₀与车辆控制井的平均值相比，数据以菌落百分比表示。

结晶紫染色

将1%结晶紫(25 mM)在含有10 μM Hoechst 33342核染剂的PBS中稀释至250 μM。取含有固定菌落的96孔板，每孔加100 μL, 6孔板加1ml，室温孵育30min。染料抽吸，用PBS洗井2倍，然后用dH洗井3倍₂O.最后的dH₂在显像前吸入O液，并让残余液蒸发。

图像捕捉

所有图像都使用Cytation™7细胞成像多模式阅读器(BioTek Instruments, Winooski, VT)捕获，该阅读器配备了宽视场(WFOV)相机，直立彩色亮场设置为2倍放大。这种成像方式可以对96孔微孔板进行单帧全井成像。为了生成6孔微孔板的全孔图像，采集5x5蒙太奇(无重叠)，然后以绿色通道作为参考通道进行缝合。选择了自动对焦和捕获分箱，以及“裁剪图像到井的大小”。在成像读取程序的高级选项中，板移动后的延迟被设置为0毫秒。

细胞分析

表1描述了用于识别井中所有对象的设置，然后应用一个亚种群来选择满足或超过50个细胞阈值对应区域的菌落:

结果

基于细胞数量的集落面积校准一群细胞作为集落的一个重要标准是存在50个以上的细胞，这是通过立体镜或直接用眼睛评估的主观上确定的^(6、7)．我们试图利用水晶紫的彩色亮场信号建立一种基于蜂群面积的自动成像分析方法。我们之前描述了一种基于Crystal Violet的荧光特性来量化菌落的自动化方法，同时使用DAPI二级掩模中的斑点计数模块验证细胞数量^[8]．为了将菌落面积与其细胞数量相关联，用Crystal Violet和Hoechst 33342染色的co2和HeLa菌落用荧光显微镜成像(图2A和2D)。从该数据集中，拟合线性回归将菌落面积与各自的细胞数量相关联(图2B和2D)。由此产生的线性方程可以估计50个细胞集落的面积，这反过来用于校准细胞分析工作流程，其中可以量化包含至少50个细胞的集落亚群(图2C和2F)。

图2．菌落大小与细胞数量的相关性。前面描述的方法^[8]荧光成像水晶紫和Hoechst 33342染色的Caco2 (A)和HeLa (D)菌落。绘制细胞簇的种群，然后拟合一个线性回归，将集落面积与细胞数量(细胞核)(B和E)相关联。重新格式化导出的线性方程，以计算50个细胞集落的估计面积。Caco2和HeLa细胞的50个细胞菌落分别对应1.03x106和9.0 0x105 mm2。将这些值应用于水晶紫染色菌落(C和F)的彩色亮场图像。比例尺= 200 μm。

图3。6孔格式的Caco2菌落。传统上，含有菌落的盘子用水晶紫染色，然后用肉眼手动计算每口井的菌落总数。

阿霉素是一种抗肿瘤药物，通过插入DNA破坏细胞分裂，抑制拓扑异构酶II的进展，最终导致大分子生物合成的抑制^{-11 (9)}．使用自动化成像和细胞分析管道，我们然后确定EC₅₀在6孔板中，对Caco2和HeLa细胞系进行多柔比星检测。成立选举委员会₅₀对于阿霉素，在阿霉素或DMSO(载体对照)存在的情况下，将co2或HeLa细胞接种到6孔板(200个细胞/孔)，每种浓度均重复三次。培养7天后，菌落固定，用水晶紫染色，用直色明场显微镜成像。应用亚群体细胞分析标准，只考虑每个孔内达到与50个细胞相关的面积截断的菌落。Caco2和HeLa的截面积分别设置为1.03 x 105 mm2和9.0 x 105 mm2。然后将每种药物浓度下合格菌落的平均值作为对数药物浓度和EC的函数绘制出来₅₀通过拟合4参数剂量-反应曲线确定。阿霉素EC₅₀对Caco2和HeLa细胞的影响分别为8.5 nM和3.1 nM(图4A和4B)。

图4．电子商务₅₀用6孔和96孔法测定阿霉素。进行集落形成试验时，将Caco2和HeLa细胞分别种在6孔板(A和B)或96孔微孔板(D和C)中，并在浓度不断增加的阿霉素存在下培养7天。使用Cytation™7细胞成像多模式阅读器进行具有宽视场的自动直立彩色亮场显微镜和晶体紫色染色菌落的细胞分析。欧共体₅₀6孔培养皿培养的Caco2和HeLa细胞，阿霉素的浓度分别为8.5 nM和3.1 nM, 96孔培养皿培养的阿霉素的浓度分别为7.5 nM和2.2 nM。

垂直彩色亮场成像高通量自动菌落形成分析

在6孔格式执行菌落形成分析的一个缺点是，衍生多点药物滴定需要多个板。或者，一个96孔板可以容纳相当于16个6孔板。我们已经成功地通过96孔微孔板格式重现了11点药物滴定(载体控制)，这也允许将样本重复数量从3个增加到8个。对于96孔微孔板格式，在多柔比星或DMSO(载体对照)的存在下，以50个细胞/孔的密度播种co2或HeLa细胞，每种浓度8个重复(每个浓度一个柱)。培养7天后，菌落固定，用水晶紫染色，并成像。细胞分析和亚种群面积截断参数设置为与6孔格式相同的值。欧共体₅₀96孔微孔板格式所得值与经典6孔格式所得值相当:Caco2 = 7.5 nM, HeLa = 2.2 nM(图4C和4D)。

结论

Cytation™7细胞成像多模式阅读器具有宽视场，能够自动垂直亮场成像和分析，是6孔和96孔微板格式的菌落形成分析的理想选择。除了提供更定量的图像分析管道外，这种自动化格式的速度非常快。96孔微孔板从图像捕获到图形的整个增强显微镜工作流程可在不到5分钟内完成。11点的EC₅₀横跨6个6孔板的样品的剂量响应曲线可以在30分钟内建立，而如果手动完成相同的样品集则需要4个多小时(表2)。总之，我们开发了一种快速、定量和可靠的方法，使用具有宽视场的Cytation 7细胞成像多模式阅读器的直立成像能力对菌落形成测定进行成像和分析。这种方法允许统计上可靠的数据采集，这对癌症治疗等药物开发应用至关重要。

表2。在6孔和96孔格式的菌落形成测定增强显微镜定时。

参考文献

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