α-突触核蛋白纤维的体外形成分析

利用荧光技术监测蛋白质在微板中的聚集

作者: Paul Held博士，应用部门实验室经理，BioTek Instruments, Inc.， Winooski, VT;凯特琳贝克尔理学硕士。Van Andel研究所，密歇根州大急流城

帕金森病是一种使人衰弱的神经系统疾病，其特征是黑质致密部神经元的选择性进行性变性和α-突触核蛋白的异常聚集。据信，蛋白原纤维或原纤维前体的细胞分泌和其他细胞随后的内吞作用在帕金森病的进展中起作用。因此，研究纤维在反应条件下的形成及其对潜在药物化合物形成的抑制是特别重要的。在这里，我们描述了使用硫黄素T染料来监测α-突触核蛋白纤维的形成。

简介

帕金森氏病是一种进行性的年龄相关神经退行性疾病，以静息性震颤、运动迟缓和僵硬为特征。这些症状被归因于中脑黑质致密部区域多巴胺能神经元的丧失。在解剖过程中，该区域的一些幸存神经元含有被称为路易小体的细胞质包涵体，主要由α-突触核蛋白组成。

α -突触核蛋白是一种富含140个氨基酸的蛋白质，最初被鉴定为与突触前神经末梢[2]的突触泡有关。与大多数这种大小的蛋白质不同，α-突触核蛋白在其单体形式中似乎没有折叠结构，并会自发地以成核依赖的方式形成纤维[3]。尽管该蛋白在本质上是胞质性的，但已发现它是通过非常规胞吐[4]分泌的。这种释放已被证明随着细胞应激的增加而增加，更聚集的形式在分泌[5]中占主导地位。这些数据表明α-突触核蛋白是帕金森病进展的路易小体扩散的关键成分[6]。

有许多不同的方法可用于研究蛋白质在体外和体内的聚集。分离方法，如电泳、尺寸排除色谱、分析离心和质谱，通过分离基于生理特征的不同蛋白质种类，如质量、电荷和疏水性[7]，确定聚合物的形成。这些方法都有一些优点，特别是在识别纤维前体和中间体方面，这取决于可用的样本量或科学问题，但有有限的吞吐量选项。光谱方法，如浊度，免疫分析(ELISA)和报告染料可以与标准化的微板使用，可显著提高通量。

图1所示。硫黄素T分子结构。苯并噻唑和氨基苯环之间的键允许相对于彼此的扭转运动，从而在激发时产生非荧光的扭曲内部电荷转移。

浊度具有探测聚集物的能力，其水动力半径大于入射光的波长，通常为350 nm。这种技术的主要优点是蛋白质不需要标记，可以用于后续的实验。聚合类型(如淀粉样蛋白与非淀粉样蛋白)之间的相对不敏感和缺乏区分，限制了其更多地用于纤维试剂外源生成和纯化的生产测试。

免疫分析技术，主要是ELISA，可用于检测淀粉样蛋白的形成，特异性突变和构象变异使用适当的抗体。虽然定量，ELISA是一个终点测量，不提供任何纤维形成的动力学信息。

染色剂或荧光染料的使用可用于高通量测定，也可用于固定组织切片的诊断工具。刚果红用于淀粉样原纤维的组织学检测已有近100年的历史，被认为是淀粉样蛋白的定义标准。

刚果红与淀粉样原纤维结合后，在偏振光下表现为苹果绿双折射[8-9]。旋转染料，如硫黄素T (ThT)被广泛用于探测淀粉样原纤维的存在，特别是淀粉样形成动力学的现场监测，因为它通常不影响聚集动力学[10]。淀粉样原纤维的形成可以通过监测作为时间函数的荧光增加来探测。与浊度的情况一样，ThT测定可以在多孔板读取器格式中进行。

该t在溶液中具有较低的荧光。它的化学结构类似于分子转子型荧光团(图1)。在溶液中，由于荧光团在其分子结构中绕中心轴旋转的能力，使激发态通过产生热量进入周围的溶液而放松，因此染料是一种贫荧光团。在纤维蛋白聚集体的存在下，染料可以滑入蛋白质的四元结构产生的空腔中(图2)。在这种状态下，旋转受到限制，导致荧光量子产率[11]显著增加。

图2。分子旋转器与有序的纤维结合。聚集原纤维中发现的β褶片状有序结构阻止硫黄素T染料的旋转，导致荧光增强。

材料和方法

黑面，透明底部96孔微板(猫# 3603)来自康宁。TopSeal-A (cat # 6050195)胶粘板封孔机来自PerkinElmer。硫黄素T (P/N T-3516)来自Sigma-Aldrich(圣路易斯，密苏里州)。所有用于原液的化学品都是试剂级的。

股票α-核蛋白原纤维

用于纤维种子的α-Synuclein原纤维事先生长，并在-80°C保存，直到需要。简单地将纯化的α-突触核蛋白(100-200μM)在50mM Tris-HCl, pH 7.5, 150mM KCl中培养数天，37℃，轨道振荡(600 RPM)，直到样品变得浑浊。硫黄素T荧光证实了纤维的形成。实验当天，在16000 g离心30分钟分离α-突触核蛋白原纤维。倒出上清液，纤维颗粒在50mM Tris-HCl, pH 7.5, 150mM KCl中重悬。最终纤维浓度由上清蛋白浓度减去A280吸光度测定。然后将原纤维稀释到适当的10倍原液浓度。

α-突触核蛋白纤维形成试验

从许多原液中制备了α-突触核蛋白纤维形成测定法。除非另有说明，反应条件如下:50 mM Tris-HCl pH 7.5;150毫米氯化钾;100 μM α-突触核蛋白单体;α-突触核蛋白纤维种子(1或10 nM);20 μM或3 μM ThT，每井最终体积为200 μL。测定过程中;先向孔中加入水、Tris-HCl和KCl溶液，然后加入α-synuclein单体，然后加入α-synuclein纤维种子。分析是由加入荧光染料开始的。然后用透明胶粘剂封板并将板装入微版阅读器。

读取参数

纤维形成评估使用a协同™2，协同H1或Cytation™3多模式阅读器(BioTek Instruments, Winooski, VT)。动态测量持续72小时，读取间隔为15分钟。读取器温度设置为37°C，读取器之间持续晃动。用激发波长440nm和发射波长480 nm测量荧光强度。Synergy 2的PMT增益设置为35,Synergy H1和Cytation 3的PMT增益设置为50。荧光测量从板的底部进行，顶部用胶粘板封条密封，以防止蒸发。

起始时间确定

随着时间的推移，荧光信号产生一个s型曲线，该曲线可以用数据的4参数物流拟合最好地描述。起始时间由曲线快速变化部分和曲线接近水平的下部的截距表示(图3)。这可以通过前面描述的[12]进行数学计算。

图3。由s型曲线确定起始时间示意图。

结果

通过将ThT与已知浓度的先前形成的蛋白原纤维孵育，测量已知纤维浓度的荧光。t显示了荧光和纤维浓度之间的线性关系(图4)。由于固定数量染料的荧光随纤维浓度的增加而增加，因此荧光信号可用于评估纤维的形成。

图4。α-突触核蛋白原纤维存在时硫黄素荧光。将浓度为3 μM的硫黄素T与原纤维在37℃的标准测定缓冲液(pH 7.5)中孵育15分钟，然后进行荧光测定。

Synergy阅读器提供线性和轨道震动模式。文献报道该t的使用浓度为20 μM。报告染料的高浓度部分是由于过去使用了不太灵敏的仪器。较新的、更灵敏的仪器可以用较低的染料浓度来使用。旋转器染料对纤维形成的影响如图5所示。当较低浓度的ThT与线性振荡同时使用时，在3 μ m和20 μ m报告染料浓度之间观察到的起效时间差别非常小(图5A)。动力学荧光曲线与归一化数据显示出非常相似的曲线。注意，20 μM ThT反应的原始荧光信号明显大于3 μM反应(数据未显示)。在轨道振荡模式下，20 μM ThT反应的起始时间明显短于3 μM ThT反应的起始时间(图5B)。这些数据与先前对淀粉样蛋白的研究一致，即ThT在浓度高于3-4 μM时形成胶束，这些胶束有助于纤维的形成[13]。

图5。线性和轨道振动的比较。两种不同的ThT浓度比较使用线性振动或轨道振动模式。

测定了盐对α-突触核蛋白纤维形成的影响。当20 μM ThT作为示踪剂时，150 mM KCl或NaCl的存在引起了非常相似的动力学曲线。虽然盐的存在比不含盐的样品产生了更大的荧光信号，但无盐样品的启动时间减少了30%(图6)。构成纤维的β折叠片等三维蛋白质结构依赖氢键形成。虽然离子的存在不是绝对必要的，但它们的存在已被证明有助于通过朊病毒蛋白[14]中的盐桥形成。反应混合物中Tris-HCl缓冲液中的残余离子可能在缺乏KCl或NaCl的反应中发挥这一作用。

图6。盐对纤维形成的影响。用20 μM ThT染料在pH为4.9的条件下检测有无150 mM KCl或NaCl时Synuclein纤维的形成。

为了提高可重复性，通常在反应中加入少量预形成的α-突触核蛋白纤维。图7展示了不同浓度的种子纤维的影响，其中比较了1 nM和10 nM的纤维种子浓度的影响。虽然两种浓度的计算起始时间比较接近，但荧光测定的纤维种子浓度越高，纤维形成的速度和范围越大。

图7。突触核蛋白纤维种子浓度对纤维形成的影响。值表示5个独立样品在每个时间点的平均荧光。

还考察了氢离子浓度的影响。虽然pH值为7.5时反应的计算起始时间较短，但与pH值为4.9时的反应相比，荧光变化的程度非常适中(图8)。有趣的是，两种反应的荧光增加发生在几乎相同的时间内，尽管变化的程度有很大不同。这些数据与淀粉样蛋白形成的结果一致，淀粉样蛋白形成在较低的pH值[15]时更容易发生。

图8。pH对α-突触核蛋白纤维形成的影响。

讨论

这些数据表明，在BioTek的Synergy™读取器中使用ThT染料可以跟踪α-突触核蛋白纤维的形成。该t与α-突触核蛋白纤维的数量有线性关系。然而，ThT本身可能具有人为辅助纤维形成的特性。当使用浓度超过4 μM时，它已被证明形成胶束，这已被认为有助于淀粉样β-折叠片[13]的形成。虽然类似的现象可能发生在α-突触核蛋白原纤维中，但ThT在浓度低于CMC时形成纤维的速度表明，染料可能有其他特性，有助于独立于胶束的纤维形成。

这些测定需要在温度控制和长时间连续振荡的情况下进行动力学荧光测定。Synergy阅读器设计了4区温度控制，以保持温度和减少整个板的变化。经过多年的使用，这些仪器已经集成了强大的震动。浓度依赖性表明轨道振动比线性振动更强烈，提供更大的剪切力。更多ThT的存在可以作为一种稳定因子，通过稳定微纤维促进纤维的形成，使它们形成更大的薄片，而不是立即消散。

因为荧光强度不是形成聚集蛋白数量的绝对度量，所以在使用这种技术定量蛋白质生产时必须小心。盐(KCl或NaCl)的存在可以促进纤维的形成，形成盐桥，使pH值低于pKa的分子通过氢键质子化。然而，这些相同的因素可以显著影响报告染料的荧光量子产率，独立于任何蛋白质纤维形成[20]。染料的消耗也会带来问题。随着荧光染料与聚集蛋白结合数量的增加，荧光增强，直到所有荧光染料都被结合。一旦自由染料被消耗掉，尽管集合体不断形成，荧光信号不再增加。如果定量使用平台期的荧光强度，则需要用标准曲线来验证荧光强度与蛋白质浓度之间的线性关系。

有许多与蛋白质聚集相关的疾病可以用类似的方式来研究帕金森病。例如，阿尔茨海默病与淀粉样蛋白的纤维细胞外致密沉积有关，这种致密形成称为老年斑。淀粉样蛋白单体是可溶性蛋白质，主要在膜中呈α螺旋状，但在高浓度[16]时发生变化，形成富含β片的结构。此外，该疾病被认为是微管相关tau蛋白异常聚集的结果，当其过度磷酸化时，可积累为成对的螺旋丝[17]。多谷氨酰胺扩张性遗传疾病，如亨廷顿舞蹈病，在特定的基因突变导致畸形的蛋白质。这些蛋白质对蛋白酶活性有抵抗力，不能被神经元细胞清除。当它们积累时，它们与具有β-片结构[18]的原纤维形成聚集体。传染性海绵状脑病(TSEs)，也称为朊病毒病，其共同元素是畸形朊病毒蛋白[19]。正常蛋白prPrPC是一种35-35kDa的蛋白质，具有一个二硫键，主要是α -螺旋结构，可被蛋白酶消化。这种蛋白质的异常构象被称为PrPsc，它对蛋白酶具有抗性，可以作为感染催化剂从以前未感染的细胞中转化更多的蛋白质，并形成可被旋转荧光染料[15]检测到的片状结构。

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