一种基于图像的方法检测和量化T细胞介导的2D和3D靶细胞模型的细胞毒性

相关视觉摘要：T细胞介导的细胞毒性的成像和定量研究

作者: Brad Larson，安捷伦科技公司;Wini Luty, Courtney Noah，BioreclamationIVT；奥利维尔·DonzeAdipoGen生命科学公司；Glauco R. Souza，德克萨斯大学健康科学中心休斯顿和Nano3D生物科学公司

摘要

T细胞介导的细胞毒性在一系列正在开发的新方法中发挥着重要作用，这些新方法的目标是增强患者的免疫系统以对抗癌症。为了评估和优化过继T细胞免疫疗法，敏感在体外方法必须包含在测试过程中。在这里描述的过程中，使用自动化活细胞成像对2D和3D靶细胞坏死诱导进行表型和定量评估。研究发现，直接激活T细胞比一般激活产生更大的细胞毒性效应，这表明T细胞可以被“教导”靶向并破坏特定的靶细胞。

简介

CD3+CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)是负责T细胞介导的细胞毒性的效应细胞，可以通过细胞间接触释放颗粒酶和穿孔素或通过Fas配体介导的毒性作用。¹作为适应性免疫系统的一部分，这些细胞发起有针对性的攻击，在不伤害健康细胞的情况下，清除体内各种受损细胞，如癌细胞。对抗这种自然防御是众所周知的事实，肿瘤发展出多种方法来避免免疫检测，并对免疫细胞产生一定程度的耐受性，旨在寻找并摧毁含有外来抗原的细胞。²多年来，治疗方法的发展避免了使用患者的免疫系统来杀死癌细胞，因为基于免疫疗法的治疗遇到了多次临床失败。不断发展的方法为癌症患者带来了新的希望。过继免疫治疗技术激活病人的T细胞体外然后再将活化的T细胞注入患者体内，选择性地靶向并摧毁肿瘤细胞。^3.

最受欢迎在体外监测CTL对靶细胞影响的方法是细胞介导的细胞毒性(CMC)试验，其中T细胞和靶细胞被添加到微皿中并共培养。传统的毒性测定是用铬(⁵¹Cr)释放预加载靶细胞。由于放射性处理的问题，以及靶细胞自发释放同位素的低灵敏度⁴，更新的方法是使用基于微板的光学方法产生发光或荧光。这些技术被优化用于检测微孔中均匀二维单层镀膜靶细胞的信号。随着适应细胞的不断增加，聚合成一个三维(3D)的配置，以创造更多在活的有机体内在类似的模型中，细胞不再均匀地分布在井底。通过显微成像和细胞分析的结合，可以实现对二维和三维镀靶细胞诱导的细胞毒性的敏感检测，以及CTL与靶细胞之间相互作用的可视化。

在这里，我们展示了一个自动化的研究方法，监测和测量CTL细胞介导的细胞毒性动力学使用数字宽视场显微镜。共培养的靶标MDA-MB-231乳腺癌细胞和成纤维细胞分别以2D和3D格式被镀，并加入活细胞凋亡/坏死试剂。使用一般方法或定向方法激活T细胞，并用远红色跟踪染料染色，然后以20、10、5或0:1的比例加入靶细胞。然后，这些板被添加到一个自动培养箱中，并使用机械臂将其运送到数字宽视场显微镜中，每4小时捕获一次亮场和荧光图像，共持续7天。动态图像的视觉观察能够监测CTL: 2D和3D培养细胞的靶细胞相互作用，而细胞图像分析可以计算整个孵育期间CTL诱导的细胞毒性。

材料与方法

材料

细胞和介质
MDA-MB-231乳腺上皮腺癌细胞(部分编号HTB-26)来自ATCC (Manassas, VA)。稳定表达RFP的人新生儿真皮成纤维细胞(部分编号cAP-0008RFP)购自angioo - proteomie (Boston, MA)。由BioreclamationIVT (Westbury, NY)捐赠的人纯化CD3+ T细胞，通过负选择从外周血单个核细胞中分离(部分编号为hrm - pbmc - tcellcd3 - m)。高级DMEM(部件号12491-015)、RPMI 1640培养基(部件号11875-093)、胎牛血清(部件号10437-036)和青霉素-链霉菌素胺(100X)(部件号10378-016)购自ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)。

分析和实验组件
IL-2 Superkine (Fc)(部件号AG-40B-0111-C010)、anti-CD3(人)、mAb (UCHT1)(部件号ANC-144-020)和anti-CD28(人)、mAb (ANC28.1/5D10)(部件号ANC-177-020)由AdipoGen生命科学公司(San Diego, CA)捐赠。SCREENSTAR 190 μ m环烯烯薄膜底部384孔微板(GBO部件号789836)，CELLSTARµClear 384孔细胞排斥表面微板(GBO部件号781976)和384孔生物检测试剂盒(GBO部件号781846，包括2瓶NanoShuttle-PL, 6孔悬浮磁铁驱动器，384孔球体和保持磁铁驱动器(2)，96孔深井混合板，6孔和384孔透明细胞排斥表面微板)，384孔环形驱动器原型，Nano3D Biosciences, Inc.和Greiner Bio-One, Inc. (Monroe, NC)捐赠了额外的Cell Repellent Surface 6-Well (GBO部件号657860)。动态凋亡试剂盒(显微镜)(部件号ab129817)由Abcam (Cambridge, MA)捐赠。CellTracker深红色染料(零件号C34565)购买自ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)。

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Cytation 5是一种模块化的多模微孔板阅读器，结合自动化数码显微镜。可使用基于滤镜和单色仪的微孔板读数，显微镜模块提供高达60倍的荧光放大倍数，亮场，彩色亮场和相位对比度。该仪器可以在一个步骤中进行多达四个通道的荧光成像。特别强调活细胞分析，Cytation 5具有震动，温度控制到65°C, CO₂/ O₂用于动力学分析的气体控制和双注射器，并由集成的安捷伦BioTek Gen5微孔板读取器和成像仪软件控制，该软件还可以自动进行图像捕获、处理和分析。2022世界杯附加赛决赛该仪器用于动态监测CTL:靶细胞相互作用以及2D和3D镀靶细胞内的细胞毒性诱导。

2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek BioSpa 8自动化培养箱
BioSpa 8自动化培养箱将安捷伦BioTek读取器或成象器与安捷伦BioT2022世界杯附加赛决赛ek清洗机和分配器连接在一起，可实现多达8个微板的完整工作流程自动化。温度、有限公司₂/ O₂湿度水平通过安捷伦BioTek BioSpa软件进行控制和监测，在所有实验阶段保持细胞培养的理想环境。2022世界杯附加赛决赛测试板在BioSpa中孵育7天，以保持适当的大气条件，并每4小时自动转移到Cytation 5进行亮场和荧光成像。

方法

概述

这项工作使用三个工作流，如图1所示。

图1所示。T细胞活化和细胞介导的细胞毒性检测工作流程。

图1左侧的第一个工作流程涉及T细胞激活，其中CD3+ T细胞暴露于使用磁场生物打印成球形的MDA-MB-231靶细胞(详细信息请参见“3D靶细胞制备”)。然后用CellTracker深红色染料对活化的T细胞进行染色，并用于生物打印的3D球形细胞毒性试验或另一种使用镀细胞的试验。CellTracker染料允许T细胞攻击目标细胞的可视化，而碘化丙啶染料允许定量与质膜破裂相关的靶细胞死亡。

三维靶细胞制备

将T-75烧瓶中的MDA-MB-231或成纤维细胞培养物培养至80%合流，然后如图2所示，用600 μL NanoShuttle-PL在37℃/5% CO下处理过夜₂．孵育后，细胞在37°C/5% CO下胰蛋白酶化3 - 5分钟₂．

图2。用于创建T细胞激活的3D球体的生物打印程序。

从烧瓶中取出细胞，以1.2 × 106个细胞/孔的浓度加入6孔细胞驱避板。在孔板上放置一个6孔磁铁驱动器来悬浮细胞，在37°C/5% CO下孵育8小时，细胞聚集和细胞外基质(ECM)形成₂．孵育后，细胞和ECM被分解，重悬，并在完全先进的DMEM培养基中以等浓度结合在一起。

对于T细胞激活，3D球体被生物打印在24孔细胞排斥微板中，使用384孔球体磁铁驱动(见“定向和一般T细胞激活”)。

采用图2所示的修改程序制备用于细胞毒性测定的3D球体。程序相同，直到球体生物打印进行。与在24孔板中生物打印T细胞激活不同，该实验使用384孔板，这样每个孔中生物打印一个球体。在384孔细胞排斥微板的每孔中，总共添加了2000个细胞(1000个MDA-MB-231和1000个成纤维细胞)。微皿在37°C/5% CO下孵育₂48小时，让细胞在每孔内聚集成共培养的类肿瘤。

2D靶细胞制备

将T-75烧瓶中的MDA-MB-231或成纤维细胞培养物培养至80%汇合。然后细胞在37ºC/5% CO下胰蛋白酶化3-5分钟₂并从烧瓶中取出。离心后，细胞被重悬，并在完全先进的DMEM培养基中以等浓度结合在一起。共有2000个细胞(1000个MDA-MB-231和1000个成纤维细胞)被添加到384孔TC处理的用于2D细胞培养的微孔中(图2)。微孔板在37°C/5% CO中培养₂过夜，让细胞附着在孔上。

定向和一般T细胞激活

每种实验条件下，共10000个靶细胞和培养基被添加到24孔细胞排斥板孔中，如下所示(图2)。定向激活:(A) 100% MDA-MB-231;(B) 75% MDA-MB-231和25%成纤维细胞;(C) 50% MDA-MB-231和50%成纤维细胞;一般激活:(D)没有细胞。在每个测试条件下，井的总容积为1ml。然后将24孔板放置在384孔球体磁铁驱动器上，在37ºC/5% CO下孵育₂4天，每口井内的细胞都聚集成多个3D球体(图3)。注意，磁铁驱动的设计密度为384口井，因此24口井的板井扩大后，每口井就有9个独立的球体。

图3。24孔板显示在定向激活开始前共培养T细胞和生物打印磁化3D靶球体。T细胞以10:1的比例加入到先前聚集成3D球体(~ 1000 μ m ID)的靶细胞中。

球形聚集后，在含有100 ng/mL IL-2 Superkine (Fc) (Superkine)和250 ng/mL anti-CD3和anti-CD28抗体的RPMI培养基中以100,000个细胞/mL的浓度制备T细胞。然后，在磁体驱动板保持在磁体驱动器上时，吸入用过的培养基以固定球体，并替换为先前描述的含有T细胞、抗体和超因子的新鲜培养基。然后将培养皿放回BioSpa中孵育6天。BioSpa被预先编程，每6小时从每口测试井中捕获12 × 10的蒙太奇图像。72小时后手动交换培养基、IL-2 Superkine和抗体。为期六天的定向激活过程不仅可以激活T细胞，还可以教会它们识别靶细胞抗原，从而实现靶向细胞毒性。常规激活遵循相同的程序，但不使用靶细胞，因此不应有靶向细胞毒性。⁵

T细胞染色和添加

激活过程完成后，包含T细胞和磁化靶细胞的24孔板被放回384孔磁铁驱动器上。然后从每个孔中取出T细胞，转移到单独的15 mL锥形管中，用CellTracker深红色染料染色，以便在细胞毒性实验期间从靶细胞分化。将浓度为1µM的染料添加到管中，在37°C/5% CO下孵育₂45分钟。然后将试管在200 RCF下离心15分钟。然后去除含有多余染料的介质，并用新鲜的RPMI介质替换。然后将每种激活条件下染色的T细胞稀释在含有10 μ L/mL动态凋亡试剂盒中碘化丙啶坏死探针的RPMI培养基中。然后将细胞添加到384孔的2D或3D细胞培养板中，总共含有2000个靶细胞，浓度分别为40,000个细胞/孔、20,000个细胞/孔或10,000个细胞/孔(图1)。这些浓度在每个孔中产生20:1、10:1或5:1的T细胞与靶细胞的比例。未处理的阴性对照井也包括在时间内检测基础靶细胞的细胞毒性水平。表1展示了最终的板布局。

表1．2D和3D细胞介导的细胞毒性实验板布局。

细胞介导的细胞毒性检测自动化程序

图4。2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek BioSpa活细胞成像系统，包括Agilent BioTek BioSpa 8和Agilent BioTek Cytation 5。

含有T细胞和靶细胞的2D和3D检测板被添加到BioSpa 8中，作为BioSpa活细胞成像系统的一部分(图4)，大气条件预先设置为37°C/5% CO₂．水也加入到锅中，以创造一个潮湿的环境，这是被监测的。安捷伦B2022世界杯附加赛决赛ioTek BioSpa软件设置后，板自动转移到Cytation 5中，每隔4小时对测试井进行亮场和荧光成像，共持续7天。表2解释了每个通道进行的成像。对于2D电镀细胞，每个通道拍摄一个4倍放大图像，以捕获每个孔的代表性细胞群。激光自动对焦是为了确保适当的聚焦在目标细胞层，以及最有效的聚焦程序。对于3D镀膜细胞，由于3D目标细胞球体内的细胞存在于多个z平面上，因此每个通道捕获由五个切片组成的z堆栈。再次采用激光自动对焦。在确定的焦平面上下各拍两张照片。

表2。每个成像通道的细胞成像。

2D和3D图像处理

捕获后，对2D和3D图像进行处理，然后进行分析。使用表3中的设置对二维图像进行预处理，以去除每个通道的背景信号。

表3。二维图像预处理参数。

对于3D图像，首先对z-stack中捕获的图像进行z-投影，以创建只包含最多焦点信息的最终图像(表4)。

表4。三维z投影准则

然后对投影图像进行预处理，再次去除每个通道的背景信号(表5)。

表5所示。三维图像预处理参数。

二维和三维处理图像的细胞分析

对处理后的图像进行细胞分析，使用表6中的标准确定坏死靶细胞发出的总信号。

表6所示。坏死细胞鉴定标准。

对3D图像进行额外的图像分析步骤，以确定T细胞处理后靶细胞球体分解的程度(表7)。

表7所示。球体解体标准。

结果与讨论

基于图像的共培养细胞相互作用检测

使用直接激活和一般激活程序激活的T细胞，以20:1、10:1、5:1和0:1的浓度添加到靶细胞中，开始细胞介导的细胞毒性试验。为了监测共培养细胞的相互作用，在加入T细胞后立即对平板进行成像，并在整个7天潜伏期中每4小时进行一次成像。

随着实验孵卵时间的增加，活化的T细胞(红色荧光)通过二维和三维形式的抗原受体结合寻找并聚集在抗原呈递靶细胞周围(图5A)。这种T细胞聚集与时间0时红色荧光更均匀的分布形成鲜明对比。

图5。细胞相互作用的Brightfield/CY5成像。4x亮场和CY5图像显示T细胞聚类和结合(A) 2D或;(B) 3D靶细胞。时间= 24小时。

当PI通道的图像与亮场通道的图像重叠时，可以观察到来自碘化丙啶坏死细胞探针的黄色荧光信号来自与结合的T细胞相同的靶细胞(图6)。这证实了T细胞结合到靶细胞的下游细胞毒性作用。

图6。细胞相互作用的Brightfield/PI成像。4倍亮场和PI图像显示坏死(A) 2D或;(B) 3D靶细胞对T细胞结合的反应。时间= 24小时。

T细胞介导的靶细胞毒性诱导的动力学成像

为了确定靶细胞内的细胞毒性诱导动力学，必须在整个潜伏期定期进行成像。由于完全的细胞毒性作用可能要在T细胞加入后数天才能达到，因此允许细胞相互作用数天也是至关重要的。Cytation 5和BioSpa 8的环境控制，以及从培养箱到成象仪的测试板的自动转移，允许在不影响细胞健康的情况下完成动力学分析。在这里进行的实验中，亮场和荧光图像每4小时捕获一次，共持续7天。图7和图8分别展示了在100% MDA-MB-231细胞存在下直接激活并以20:1的比例添加的T细胞对2D和3D培养靶细胞的迭代细胞毒作用。

图7。二维细胞毒性靶细胞诱导的CY5/PI成像。4倍CY5和PI重叠图像，显示染色的T细胞和碘化丙啶坏死细胞探针的信号，跟随(A) 0;(B) 48;(C) 96;共培养潜伏期168小时。

图8。三维细胞毒性靶细胞诱导的Brightfield/CY5/PI成像。4倍重叠的亮场、CY5和PI图像显示染色的T细胞和碘化丙啶坏死细胞探针(A) 0后的信号;(B) 48;(C) 96;共培养潜伏期168小时。

靶细胞毒性的定量研究

图像捕获后，定量T细胞诱导的靶细胞细胞毒性水平。

图9。靶细胞毒性的细胞分析。4x图像显示碘化丙啶坏死细胞探针96小时孵育后的荧光。对象蒙版(蓝色)放置在(A) 2D和;(B)符合细胞分析标准的3D培养靶细胞。

使用表6中描述的优化图像分析标准，物体掩模放置在符合PI坏死细胞探针的最小阈值信号标准的细胞周围(图9)。由于T细胞在2D或3D格式中与目标细胞相比具有更小的尺寸，因此设置最小物体尺寸截断值，使单个坏死T细胞不包括在分析中。这可以在图9A和9B中看到。

在三维CMC实验的动力学图像中还观察到的一个现象是，随着细胞毒性的增加，类肿瘤开始分解，将成群的细胞释放到周围的介质中。虽然这些聚集物比完整的类瘤体小，但仍然比单个T细胞大，并且也从PI坏死细胞探针发出信号，因此被包括在最终分析中(图9B)。

根据所进行的分析，计算2D培养靶细胞每张图像的坏死细胞数量。当在3D环境中培养时，肿瘤内的细胞和较小的聚集体存在于多个z平面上。因此，为了以最高水平的准确性量化诱导的细胞毒性，对每张图像中所有物体掩膜内的总PI信号进行了量化。在Gen5软件中，每个时间点计算的值(细胞数或总PI信号)自动除以时间0时计算的值。这样，重复之间的小差异就被归一化了。分析后，绘制结果以评估在不同测试条件下诱导靶细胞的细胞毒性是否存在差异。图10中的图表显示了与未激活的T细胞相比，以20:1的比例添加到测试孔中，在100%、75%、50%或0% MDA-MB-231细胞存在下激活的T细胞的计算数据。

从图10可以明显看出，在2D和3D细胞模型中，T细胞诱导的细胞毒性随着细胞定向活化程度的增加而增加。在100% MDA-MB-231细胞存在下激活的T细胞引起最高水平的细胞毒性，而仅在抗体和超因子存在下激活的T细胞引起的每个图像的坏死细胞数量比基础坏死细胞数量增加最低。然而，这些模型在动力学反应上有所不同。在2D模型(图10A)中，T细胞介导的细胞毒性在加入活化T细胞后约24小时达到峰值，这可以从含有T细胞的孔中的坏死细胞与阴性对照孔中的坏死细胞数量的比率中得到证明。任何超过3天的进一步坏死都是由于2D模型的局限性，阴性对照中随着时间的推移坏死明显增加。相反，在3D模型中(图10B)， PI探针总信号的坏死比率在动力学运行过程中继续增加或稳定，这是由于未经处理的3D细胞模型中细胞健康状况得到了更好的保留。

然后在含有100% MDA-MB-231细胞直接激活的T细胞的孔中进行坏死细胞诱导分析，然后按20:1、10:1、5:1的比例添加到2D和3D镀金靶细胞中进行CMC测定。靶细胞未经处理时也纳入阴性对照。

图10。活化方案细胞毒性诱导分析。比较在抗cd3和抗cd28抗体、superkine、100% MDA-MB-231细胞、75% MDA-MB-231/25%成纤维细胞、50% MDA-MB-231/50%成纤维细胞、或无细胞时激活的T细胞诱导细胞毒性靶细胞的情况。未激活T细胞的数据也包括在内，并使用左y轴绘制。右侧y轴为未经处理的阴性对照靶细胞的坏死细胞计数或总PI信号随时间的变化。结果显示T细胞与(A) 2D培养靶细胞孵育;或(B) 3D培养靶细胞7天。

从图11可以明显看出，在2D和3D模型中，T细胞介导的细胞毒性在不同T细胞与靶细胞比例下随时间的动力学响应。这些发现与之前的激活协议比较结果一致(图10)，以及报告的结果在活的有机体内测试。

图11。T细胞浓度的影响。细胞毒性靶细胞诱导T细胞加入孔的浓度分别为40000细胞/孔(20:1比例)、20000细胞/孔(10:1比例)、10000细胞/孔(5:1比例)和0细胞/孔(阴性对照)。T细胞与(A) 2D孵育的结果显示;或(B) 3D培养靶细胞7天。

最后，当靶细胞在3D中培养时，定向激活的效果也可以使用明场通道来测量。这是因为在细胞毒性T细胞效应的作用下，类肿瘤随着时间的推移而分裂，或爆炸，释放细胞和细胞外基质。使用Gen5的汇流测量能力和表7中优化的指标，可以量化类肿瘤的解体程度。只有每个图像中亮场信号低于上阈值标准的像素才包含在汇流百分比计算中。当在第5代中查看时，异常点像素显示为白色(图12)。

图12。利用亮场信号确定图像汇流。4倍亮场图像后进行图像分析和%汇流测定。未包含在汇流计算中的像素显示为白色。(a) 72与10:1 T细胞与靶细胞比例的细胞相互作用和结合后显示的图像;(B) 116;(C) 136;(D) 168小时的潜伏期。

百分比汇合值可以随着时间的推移绘制，以可视化响应增加T细胞与靶细胞比率的类肿瘤解体动力学。

图13中的曲线说明了如何绘制合流随时间的变化来解释最终效应的动力学。正如预期的那样，高浓度的活化T细胞比低浓度的活化T细胞更快地破坏类肿瘤。未处理的类肿瘤也表现出很少的合流变化，因为很少或没有看到细胞毒性(图10B)，允许类肿瘤在七天潜伏期内保持完整。

图13。动态百分比图像汇合量化。三维肿瘤崩解引起的动态亮场图像百分比汇合点图。

结论

研究发现，与不使用靶细胞的一般激活相比，将T细胞长时间暴露在靶细胞中，直接激活T细胞可显著增加细胞毒性。此外，如果目标细胞与成纤维细胞在活化过程中共培养，则效果明显减弱:成纤维细胞比例越大，细胞毒性明显越小。这表明T细胞可以在激活过程中被指示寻找并破坏靶细胞。

3D细胞模型远优于2D细胞模型，因为在整个长时间的动力学运行过程中，细胞健康状况得以保持。细胞毒性可以用碘化丙啶来测量质膜破裂，也可以用brightfield(无标记)来测量球体解体引起的合流增加。

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