三维间充质干细胞球体分化的自动步行系统

作者: Brad Larson，安捷伦科技公司;Glauco Souza,Nano3D生物科学公司;Jan Seldin他一一Bio-One

简介

人类间充质干细胞(hMSCs)具有多能性，存在于身体的多个区域，包括骨髓、骨骼肌、真皮和血液。这些细胞以其易于分离和分化成熟为多种谱系的能力而闻名，包括脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞。hMSCs在成人组织修复中也发挥着重要作用，因此在组织工程应用中具有重要意义。例如，由于成人软骨不能自我修复，软骨细胞来源的hMSCs可用于软骨修复应用，事实上，球形软骨细胞移植已被研究用于治疗髋关节软骨缺损。¹最初的hMSC实验涉及单层二维(2D)细胞培养。然而，以这种方式培养细胞会导致细胞的复制能力和分化能力的丧失。^2、3许多技术，培养hMSCs在三维(3D)格式，然后纳入，如颗粒和微质量培养。^4、5这些方法更好地说明了分化过程，但缺点包括需要大量的细胞，手工处理步骤困难，并且每种方法的总成本较高。最近开发的3D细胞培养技术能够在高密度微板中从较小数量的细胞中创建球体，可以克服早期方法的局限性，同时仍然为适当的干细胞分化提供必要的环境。

从多能hMSCs到最终目标谱系(如软骨细胞)的完全分化通常需要14至28天。由于需要每2 - 3天更换一次介质，手工操作不仅繁琐，而且在处理非附着细胞时，会增加意外球体移除的风险。自动化处理步骤并结合3D生物磁打印方法，使研究人员可以执行其他任务，并提高了可重复性，几乎没有球体丢失的风险。在这种方法中(图1)，细胞首先与由金、氧化铁和聚l -赖氨酸组成的生物相容性磁性纳米颗粒组件一起孵育，它可以磁化细胞而不会引起有害的生物效应。然后将细胞放入微孔板中，通过在微孔上方放置磁铁使细胞悬浮，在那里它们聚集并在几小时内形成细胞外基质(ECM)。悬浮后，移除磁铁，通过温和的移液作用将3D聚集体解离成由单细胞和小细胞聚集体组成的分散细胞悬浮液。然后将细胞转移到384孔的检测板上，并在板下放置一个球形磁铁进行适当的孵育期，允许每个孔内的细胞被绘制成球形结构。磁化的球体可以在定期的媒体交换中保持完整。

在这里，我们演示了一种组合解决方案的验证，从3D hMSC球体执行自动化软骨细胞分化，其中所有仪器都包含在层流罩中。带有磁性板适配器的组合清洗机/分配器用于介质交换，而自动培养箱在交换之间保持适当的微孔板环境条件。在介质交换后进行环境控制下的无标签细胞成像，以确认处理过程中球状体的维持。分化后的免疫荧光证实了该系统用于临界干细胞分化的有效性。3D生物磁打印、自动液体处理和培养以及基于图像的分析相结合，提供了易于使用的、可靠的方法来优化hMSC球体的生成和分化过程。

图1所示。BiO检测试剂盒协议。384-Well BiO Assay Kit使用NanoShuttle-PL纳米颗粒组件磁化细胞。孵育后，细胞分离，重悬在细胞排斥板中，并磁悬浮聚集和诱导ECM。在分解聚合体后，单个细胞被转移到384孔的细胞排斥板上，板上放置384孔磁铁，在井底打印。

材料与方法

材料

细胞

正常人骨髓来源间充质干细胞(部分编号PT- 2501)、间充质干细胞生长培养基(MSCGM)防弹试剂盒(部分编号PT-3001)和hMSC软骨细胞防弹试剂盒(部分编号PT- 3003)由龙沙(瑞士巴塞尔)捐赠。

抗体和抑制剂化合物

山羊抗itgb1 /CD29抗体(零件号ED08199)购自Everest (Oxfordshire, UK)。兔抗cd44单克隆抗体[EPR1013Y](零件号ab51037)、小鼠抗cd166单克隆抗体[8E12C7](零件号ab175428)、兔抗Collagen II多克隆抗体(零件号ab34712)、驴抗山羊IgG H&L (Alexa Fluor 488)多克隆抗体(零件号ab150129)、驴抗兔IgG H&L (Alexa Fluor 647)多克隆抗体(零件号ab150075)购自abcam (Cambridge, UK)。山羊抗小鼠IgG H&L (Alexa Fluor 594)多克隆抗体(部件号A-11032)和Alexa Fluor 488 Phalloidin(部件号A-12379)购自ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)。Hoechst 33342(零件号14533)购自Sigma-Aldrich(圣路易斯，密苏里州)。

分析和实验组件

384孔生物检测试剂盒(GBO部件号781846，包括2瓶NanoShuttle-PL, 6孔悬浮磁体驱动，384孔球体和持有磁体驱动(2)，96孔深井混合板，6孔和384孔透明细胞拒接表面微板)，384孔环形驱动原型和额外的细胞拒接表面6孔(GBO部件号657860)由Nano3D生物科学公司(休斯顿，德克萨斯州)和Greiner BiO - one公司(门罗，北卡罗来纳州)慷慨捐赠。

2022世界杯附加赛决赛Agilent BioTek Cytation 5细胞成像多模式阅读器

Cytation 5是一个模块化的多模式微孔板阅读器结合自动化数字显微镜。基于滤镜和单色仪的微孔板读数可用，显微镜模块提供高达60倍的荧光放大倍数，亮场，彩色亮场和相位对比。该仪器可以在一个步骤中进行多达四个通道的荧光成像。特别强调活细胞分析，Cytation 5具有温度控制，CO₂/ O₂气体控制和双注射器进行动力学分析，并由集成的安捷伦BioTek Gen5微孔板阅读器和成像软件控制。2022世界杯附加赛决赛该软件还用于双掩蔽和自动分析。

2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek BioSpa 8自动化培养箱

BioSpa 8自动化培养箱将安捷伦BioTek读取器或成象器与安捷伦BioT2022世界杯附加赛决赛ek清洗机和分配器连接在一起，可实现多达8个微板的完整工作流程自动化。温度、有限公司₂/ O₂湿度水平通过安捷伦BioTek BioSpa软件进行控制和监测，在所有实验阶段保持细胞培养的理想环境。2022世界杯附加赛决赛

2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek EL406组合洗衣机分配器

EL406通过其双作用歧管提供快速，准确的介质清除和洗板功能。它还通过使用蠕动泵或注射泵提供试剂分配功能，容量从500 nL到3000 μL/井。在介质传输过程中，使用了专用磁铁适配器(零件号7182104)和384孔平面磁铁(零件号7103017)来确保3D球体的放置。

方法

细胞制备和球体形成

hMSCs从低温保存中解冻，在完整的MSCGM培养基中重悬，并按供应商推荐的方案以5000个细胞/平方厘米的浓度分配到三个单独的T-75烧瓶中。细胞在烧瓶中繁殖7天，细胞融合度达到80%。然后将600 μ L体积的NanoShuttle-PL添加到每个烧瓶中并孵育一夜。从烧瓶中取出细胞，以1.2 × 10的浓度添加到6孔细胞驱避板中⁶细胞/mL，体积为2ml /孔。在平板上放置一个6孔磁铁驱动器来悬浮细胞，在37°C/5% CO孵育8小时后，细胞聚集并诱导ECM形成₂．孵育后，细胞和ECM被分解并重悬。共有5000个细胞被添加到384孔细胞排斥微板的孔中，用于3D球体形成，同时共有10,000个细胞被添加到384孔细胞培养微板的孔中，用于在50µL的间充质干细胞完全生长介质中进行2D细胞培养。这一过程被复制了用于每种细胞培养方法的总共四个微板。每块三维球体板下放置一块磁铁。所有微板均在37℃/5% CO下孵育₂大约48小时，使2D细胞附着在微孔板井底，并使3D细胞在每口井内聚集成球体。

hMSC确证成像

在开始分化过程之前，对未分化的3D培养球体进行免疫荧光染色，通过表1中概述的程序，通过常见生物标志物蛋白的表达来确认正确的hMSC功能。采用普遍接受的染色方法对2D培养细胞进行未分化hMSC染色。hMSC CD29、CD44和CD166表面抗原标记物的表达使用表2所示的特异性一抗和二抗进行评估。

表1。球体固定和染色程序。

表2．抗原一抗和二抗。

对3D球体或2D培养细胞进行免疫染色后，分别使用20x或10x物镜，使用表3中所列的荧光通道成像。

表3。荧光探针和Cytation 5成像通道设置。

自动干细胞分化

在培养以允许2D细胞附着和3D球体形成后，将板置于37°C/5% CO的BioSpa 8中²在分化期长达20天。BioSpa 8方法的编程是，在第0天，板自动移动到EL406，随后每三天更换一次相应的介质。EL406配备了专用磁铁适配器和384孔扁平磁铁，在液体处理过程中确保3D球体的安全。静置1分钟后，球体被磁性固定在井底，之后EL406的抽吸销从每个微孔板的井中去除75%的废培养基，并通过周围泵向阴性对照井添加新的生长培养基，每孔的总体积为50 μ L，而软骨细胞分化培养基以同样的方式分配到阳性对照井。在交换培养基后，BioSpa 8臂自动将每个培养皿从EL406移到Cytation 5，在那里进行亮场成像，以确认培养基交换成功而没有细胞损失。表4中列出的参数用于精确聚焦hMSC球体，并将蒙太奇瓷砖拼接成最终图像。

表4。细胞5成像参数

II型胶原蛋白的表达，这是健康软骨的重要组成部分⁶以及软骨细胞分化的验证⁷，使用表5中的抗体进行检测。

表5所示。胶原蛋白一抗和二抗。

此外，在第5、10和20天，分别从BioSpa 8中取出一个含有2D细胞和3D球体的微皿，并按照上述程序进行荧光免疫染色以检测胶原蛋白的形成。每个被移除的检测板都被一个占位符微孔板取代，以维持机器人方案。

结果与讨论

hMSC确证成像

正常的hMSC功能是通过确认普遍表达的表面抗原标记物的存在来验证的。如图2所示，在2D培养细胞和3D培养球体中检测到CD29、CD44和CD166表面抗原标记物对应的荧光信号。结合的一抗和荧光标记的二抗信号在每张图像中显示为点状点，表明在2D或3D培养细胞中抗原表达的不同区域。

图2。hMSC生物标志物的表达，如Cytation 5成像。箭头表示免疫荧光鉴定蛋白表达，以确认(A) 2D培养细胞的正常细胞功能，使用10x物镜和;(B) 20x物镜三维培养球体。DAPI: Hoechst 33342染色核，GFP: CD29表达，德州红:CD166表达，CY5: CD44表达。

自动干细胞分化

在指定的培养基交换期间，进行明场成像，以确认细胞和球体在抽吸和分配过程中保持完整。如图3A至3C所示，在整个20天的孵育过程中，在介质交换过程中，3D球体被证实在井中保持完整。同样的情况也适用于培养10天的2D细胞(图3D和3E)。然而，在培养皿中培养10天后，交换培养基后可见细胞损失(图3F)。这一观察证实了之前的研究发现，2D培养的细胞在培养10天后失去完整性、分离并变得不可活。⁸

然后通过比较在分化培养基中培养的细胞与在生长培养基中未分化的细胞来检查2D培养细胞中的软骨细胞分化。根据图4，最初的软骨细胞分化(图4D)在孵育5天内可见，并在10天内迅速达到峰值(图4E)，相比之下，在培养基中培养的细胞没有分化(图4A至4C)。10天后，所有2D培养细胞都失去活力;在分化细胞中，II型胶原荧光探针浸出到周围介质中(图4F)。这证实了在长期研究中纳入2D分化hMSCs的局限性。

图3。媒体后交换成像验证。第5天、第10天和第20天使用4倍物镜(a到C) 3D球体拍摄3 × 2蒙太奇亮场图像;(从D到F) 2D培养细胞在第10天开始出现明显的细胞损失。

图4。2D培养hMSC软骨细胞分化随时间的变化。第5天，第10天，第20天(A到C)未分化细胞的图像;和(D到F)分化细胞，使用10倍物镜捕获。DAPI: Hoechst 33342染色细胞核，GFP: AlexaFluor 488 phalloidin染色肌动蛋白丝，CY5: II型胶原蛋白表达。

以同样的方式，通过比较在分化培养基中培养的球体与在生长培养基中未分化的球体来检测3D培养球体中的软骨细胞分化。根据图5A到5C，未分化的球状体中没有可见的胶原蛋白表达，而分化的球状体中胶原蛋白的表达随着时间的推移稳步增加(图5D到5F)。这证实了3D培养和分化的hMSC球体适合长期研究。此外，将分化后的椭球图像在单独的z面进行叠加(图6)，以提高图像清晰度并实现分化量化。

图5。三维培养hMSC球形软骨细胞随时间的分化。第5天、第10天和第20天(A到C)未分化球体图像;和(D到F)分化的球体，使用20x物镜捕获。DAPI: Hoechst 33342染色细胞核，GFP: AlexaFluor 488 phalloidin染色肌动蛋白丝，CY5: II型胶原蛋白表达。

图6。三维椭球体图像的z -叠加与投影。(A到C)各个z平面的图像。(D)软骨细胞分化hMSC球体的最终z投影图像。箭头表示细胞核、胶原蛋白和蛋白质表达。DAPI: Hoechst 33342染色细胞核，GFP: AlexaFluor 488 phalloidin染色肌动蛋白丝，CY5: II型胶原蛋白表达。

通过细胞分析量化软骨细胞分化

使用z-堆叠图像，Agilent BioTek Gen2022世界杯附加赛决赛5软件自动对样本进行预处理，以去除多余的背景信号，并准备图像进行定量分析。主要的细胞分析标准被应用于在整个球体周围放置一个对象掩模。然后使用二次分析标准自动掩盖球体内来自II型胶原抗体标记的CY5信号大于背景阈值水平的区域，如图7中的箭头所示。

图7。自动双掩码分析，主要掩码放置在整个球体周围，次要掩码放置在增加CY5信号的不连续区域周围。

CY5区域覆盖率的百分比，表明更大的分化和II型胶原蛋白的表达，然后可以计算为二级面膜与初级面膜的比率，表示为百分比。图8中的最终百分比值表明，与未分化的hMSC球体相比，软骨细胞分化的hMSC球体中II型胶原的产生显著增加，从而验证了3D培养的hMSC球体可以成功分化为软骨细胞。

图8。CY5信号相对于背景阈值随时间的变化。

结论

由nano3D Biosciences公司生产的384孔生物分析试剂盒和NanoShuttle-PL颗粒，结合Greiner BiO - one细胞排斥表面6孔和384孔微板，提供了一种简单而可靠的方法来创建仿生hMSC球体。通过将Agilent BioTek BioSpa 8和Ag2022世界杯附加赛决赛ilent BioTek EL406上的磁性适配器结合在一起，可以自动化分化过程，以简化和增加所包含程序的可重复性。然后可以使用Agilent BioTek Cytation 5的明场和荧光成像进行自动化和分化确认。2022世界杯附加赛决赛该组合提供了一种经过验证的方法来进行3D培养干细胞的分化。

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