2009年3月20日
作者: Paul Held博士，高级科学家，BioTek Instruments, Inc.应用部门
摘要
细胞增殖和细胞毒性研究是细胞生物学和癌症研究的主要内容。细胞增殖研究涉及到评估不同分子诱导细胞生长和增殖的能力，而抗肿瘤化疗研究通常涉及到药物特异性杀伤肿瘤细胞的能力的调查。无论哪种情况，对细胞数量随时间变化的评估都是研究的关键组成部分。在这里，我们描述了使用Synergy™Mx基于单色仪的多模式微板阅读器，使用Dojindo的WST-8细胞计数套件定量细胞。
简介
组织培养细胞的定量一直是确定促进或抑制细胞生长的药剂的功效的标志。虽然在悬浮液中生长的细胞可以直接计数，但大多数组织培养是在单层培养中生长的，这需要在定量之前使用蛋白水解剂(如胰蛋白酶)进行分散。分散的细胞可以直接定量的手动使用显微镜和血细胞计或在自动细胞计数器。这些方法速度慢，劳动强度大，需要对单个样品进行单独定量。
有许多不同的间接方法定量细胞数量与大量的样品使用微板。简单的总蛋白和核酸检测间接提供了有关细胞数量或更具体地说细胞数量变化的信息，其基础是细胞平均具有恒定数量的这些聚合物。这些聚合物的增加或减少将分别指示细胞增殖或细胞毒性。然而，这些测定不一定能提供有关细胞活力的信息，一些“活细胞”测定法已经被开发出来。首先发展的方法之一是3h -胸腺嘧啶的合并。只有活细胞才会将这种可追溯的放射性部分合并成可酸沉淀的核酸。虽然这种方法非常有效和具体，但样品制备过程漫长，使用放射性，具有固有的危险、规章和处理费用。已经开发了几种非放射性测定方法。这些测定采用了诸如吸收、荧光和发光等检测技术。
检测ATP(一种只存在于活细胞中的不稳定高能分子)存在的检测方法可以通过它与荧光素酶相互作用时产生的发光来测定。通过细胞代谢直接从无色化合物转化而来的底物包括荧光化合物钙黄素，以及许多四唑盐。四唑盐被酶还原生成彩色福马赞染料。这些盐中最早和最著名的是MTT，它产生一种彩色的不溶性产品，必须与乙醇[1]溶解。对四唑底物进行改进，得到了具有水溶性产物的化合物;乐鱼平台入口第一个是WST-1。该化合物的最大吸收波长为438 nm。对四唑盐的进一步改进提高了反应性和摩尔吸收率，同时降低了毒性。
Dojindo的细胞计数试剂盒使用WST-8结合电子介质1-甲氧基PMS来评估存活细胞。四唑盐，WST-8，通过与1-甲氧基PMS的还原形式反应被还原。这种介质位于细胞膜上，直接与NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原形式)或NADPH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸还原形式)发生反应(图1)。NADH和NADPH是由NAD+或NADP+通过脱氢酶及其底物(如乳酸脱氢酶和乳酸)的反应生成的。因此，利用四唑盐来测定脱氢酶活性或脱氢酶的底物。
WST-8四唑盐的溶液几乎是无色的，而它的福马甲产品给出了一个颜色强烈的溶液，峰值吸光度在460 nm。
图1。WST-8分析机理。
材料与方法
细胞计数试剂盒(CCK-8)从Dojino分子技术公司(Rockville, MD)获得。无菌96孔清底微板，目录号3603，来自康宁(Corning, NY)。培养基、胎牛血清、胰岛素和抗生素从Invitrogen(卡尔斯巴德，CA)购买。
小鼠C-10肺上皮细胞在添加10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12中培养。细胞经过胰蛋白酶化后，以75000个细胞/mL的浓度重新悬浮在新鲜培养基中。用DMEM/F12和10% FBS作为稀释剂进行连续稀释(1:2)。然后将每个细胞稀释液的等量(200 μ L)移液到96孔微板中。细胞在37°C的5%湿润CO中生长一夜2环境。第二天用细胞计数试剂盒CCK-8对细胞进行定量检测。按照试剂盒说明书进行细胞定量。简单地说，20µL的准备使用的试剂盒试剂直接添加到96孔板的细胞培养中，96孔板有200µL的培养基。细胞在37°C, 5% CO的潮湿环境中培养22个小时。孵育后，使用Synergy Mx多模微板阅读器(BioTek Instruments)测定460 nm处的吸光度。
在细胞毒性制剂研究中，将原代人间皮瘤细胞以每孔5000个细胞、200 μ L体积的数量接种于添加10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中。让细胞在37°C的5%湿润CO中生长48小时后2在不同浓度(0 ~ 40 μ M)的抗生素、硫链菌素添加到细胞中。暴露于药物24小时后，将10 μ L的细胞计数试剂直接添加到细胞培养物中。在37°C的5%湿润CO中孵育120分钟2环境。如前面所述，使用Synergy™基于单色仪的多模微板阅读器在460 nm下测量WST-8福马甲产品。
使用Synergy Mx多模式Microplate Reader对反应和未反应的细胞培养进行光谱扫描。发生反应的孔中含有大约20,000个原发性间皮瘤细胞，而未发生反应的孔中只有培养基。吸光度测量从300 nm到700 nm，每增加1 nm。在所有实验中，读取器均由Gen5™数据分析软件(BioTek Instruments, Winooski, VT)控制并收集数据。
图2。WST-8福马赞的光谱扫描。在与WST-8福尔马桑产物(品红)或未反应的WST-8(蓝色)反应的样品中，以1 nm的增量测量了从300 nm到700 nm的吸收光谱。
结果
对已反应的WST-8和未反应的WST-8在460 nm处的吸光度进行光谱扫描。注意，酚红指示染料的吸光度峰可以在560 nm处看到一个小的吸光度折痕。苯酚红吸收峰在460 nm处与WST-8福马甲产物峰很容易区分。这允许用户选择使用含有苯酚红的介质。由于苯酚红的存在，在460 nm处吸光度的增加对所有孔都应该是相同的，可以通过使用苯酚红空白孔来减去。
图3展示了该方法测定孔内不同数量细胞的能力。当连续稀释的小鼠C-10肺上皮细胞被接种到96孔微板中，并在第二天进行检测时，在460 nm处观察到吸光度的线性响应。
图3。细胞滴定。
抗生素硫代链球菌的效果见图4。Thiostrepton被认为是通过下调FoxM1的表达和诱导[2]细胞凋亡而起作用的。药物浓度的增加导致460 nm处吸光度的下降，表明存活细胞的数量减少。在半对数轴上测得的剂量-反应曲线为经典的s型曲线。在此条件下计算的EC50为7.4 μ M。
图4。硫链球菌细胞毒性曲线。
讨论
Dojindo的WST-8细胞定量试剂盒是用于细胞增殖或细胞毒性研究的细胞数量快速测定的理想解决方案。该试剂盒提供了一个现成的试剂，可以直接添加到细胞培养中，而不需要收集或清洗细胞。最终产品在水溶液中是高可溶性的，因此是无毒的，在测量吸光度之前不需要溶解。它的高水溶性和低毒性也允许随着时间的推移重复测量。这对少量细胞尤其有利，因为细胞可能需要长时间的孵育才能产生足够的信号。
增殖或细胞毒性研究的细胞数量很容易量化。通过将实验条件下获得的吸光度与已知单元数的已有校准曲线进行比较，可以计算出单元数。注意，为了进行准确的比较，实验和校准实验的测定反应时间和孵育条件必须相同。或者，在不同条件下产生的吸光度的相对量可以在独立于实际确定细胞数量的实验中进行比较。例如，如图4所示，我们可以得出结论，与1 μ M的硫链蛋白相比，40 μ M的硫链蛋白24小时的存活细胞明显更少。
使用四唑板进行细胞定量有几个注意事项。由于测定的基础是活细胞的固有脱氢酶活性，影响脱氢酶活性的处理可能会导致实际活细胞数量与使用WST-8测定的细胞数量之间的差异。WST-8等四唑盐也可直接与DTT或b-ME等还原剂相互作用;结果在460 nm处吸光度增加。如果不能避免使用这些试剂，可以使用培养基的背景减法(没有细胞)反应来否定这一点。用CCK-8试剂培养的培养基有轻微的自发增加的报道。背景吸光度的增加与培养基、pH值、孵育时间和光照有关。同样，这可以通过减去无单元格空白来纠正。注意，CCK-8试剂本身的吸光度没有任何增加。
Synergy™Mx基于单色仪的多模微板阅读器是一种理想的多用途阅读器。阅读器使用单色仪为吸光度和荧光测量提供波长特异性。这些硬件功能允许用户测量样品的荧光或吸光度，而不必担心有必要的过滤器。此外，两种读取模式下的光谱扫描都可以由microplate阅读器自动执行。该阅读器与Gen5™数据分析软件(BioTek Instruments)一起使用。除了控制读取器功能，Gen5还收集和存储生成的数据。Gen5还能够自动绘制校准曲线，计算未知浓度，验证检测性能，并提供检测报告。
参考文献
1.Mosmann T(1983)。细胞生长和存活的快速比色法:在增殖和细胞毒性测定中的应用”。免疫学方法杂志。65：55 - 63。
2.Kwok, J. S. Myatt, C. Marson, R.S. Coombes, D. Constantinidou, E. Lam(2008)硫链蛋白通过抑制叉状盒M1表达选择性靶向乳腺癌细胞。分子癌症疗法。7：2022 - 2032。