使用自动划痕创面创建、高对比度亮场和荧光动力学成像的高级伤口愈合分析工作流程

作者: Brad Larson，安捷伦科技公司

摘要

多种成分，包括细胞外基质和基质细胞，在构建过程中发挥作用在活的有机体内组织或癌细胞模型。当进行划痕愈合试验以确定这些模型中包括的目标细胞类型的迁移模式时，重要的是创建最在活的有机体内类似临床前设置在体外测试。目前执行划伤分析的标准包括手工损伤非涂层板底部的细胞层，以及无标签的细胞分析。随着自动创口方法的加入，除了从单个细胞和共培养细胞中捕获动态图像和分析亮场和荧光信号外，还可以生成健壮的数据，以便准确评估潜在的伤口闭合促进作用或防止转移性细胞迁移。

简介

肿瘤微环境的几个组成部分是已知的在活的有机体内疾病进展和转移行为。细胞外基质(ECM)就是其中一个影响因素。ECM是一种复杂的细胞支架，遍布全身，由胶原蛋白、细胞粘附糖蛋白和其他蛋白质组成。ECM支持粘附和细胞内通信网络，也促进细胞迁移，包括作为一个集体群体的方向性。¹这种类型的迁移是伤口愈合和肿瘤转移的一个重要方面，肿瘤转移是癌症发病率和死亡率的主要原因。²此外，还发现了基质细胞，如成纤维细胞在活的有机体内细胞模型常用来研究在体外擦伤愈合方法。成纤维细胞负责沉积ECM成分，并在实体肿瘤微环境中影响癌细胞的迁移、侵袭和其他致瘤过程。^3.这些细胞广泛存在于胰腺癌、肺癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)等癌症中。^{4 - 6}由于ECM和基质的重要作用在活的有机体内，每一个都应该包括在表演时在体外细胞迁移研究以增加生成数据的相关性。

伤口愈合或划痕试验是一种直接和广泛使用的方法来测量细胞迁移。在该方法中，一旦培养的细胞达到汇合点，单层被机械划伤，从而创建一个无细胞区，对一些细胞模型模拟伤口区域。然后，随着时间的推移，对聚集的细胞迁移到细胞游离区进行动力学成像，以表征细胞在不受抑制或受测试分子影响时的运动。当手工制造伤口时，通常使用移液管尖端，伤口的宽度、方向和在井内的位置很难标准化。⁷如果没有重复性，复制孔内和滴定间的计算测量的可变性会使有关细胞迁移行为的最终结论复杂化。

在这里，我们演示了使用一种新颖的自动化工具，在微孔板底部形成的细胞单层中创建一致的和可复制的划痕。我们使用单个癌细胞模型以及成纤维细胞和癌细胞的共培养;每个镀在胶原蛋白涂层微孔板更接近模拟在活的有机体内微环境和促进细胞迁移。该工具适用于任何尺寸的层流罩，具有可互换的销管歧管，可与24井或96井板使用，以及预编程的免提清洗和去污协议，以降低污染风险。划痕生成后，平板被转移到安捷伦BioTek自动成像仪或安捷伦BioTek BioSpa活细胞成像系统，使用高对比度亮场和荧光成像动态监2022世界杯附加赛决赛测细胞迁移。

材料与方法

材料

细胞:HT-1080纤维肉瘤细胞(零件号CCL-121)购自ATCC (Manassas, VA)。表达RFP(部分号cAP-0008RFP)的人新生儿皮肤成纤维细胞购自Angio-Proteomie (Boston, MA)。表达GFP的U-87胶质母细胞瘤细胞由Sachin Katyal博士(马尼托巴大学，温尼伯，马尼托巴，加拿大)慷慨捐赠。

实验部分:高级DMEM(零件号12491-015)、胎牛血清(零件号10437-036)、青霉素-链霉素-谷氨酰胺(100x)(零件号10378-016)、TrypLE表达酶(1x)、酚红(零件号12605-010)、Alconox粉状精密清洗剂(零件号16000 -104)和vircon -s(零件号NC9821357)从ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)购买。I型胶原蛋白，牛(FITC)(零件号C7510-11)从美国生物公司(Salem MA)购买。乙酸(零件号A6283)购自Millipore Sigma。24孔透明tc处理多孔板(零件号3524)和96孔透明平底聚苯乙烯tc处理微板(零件号3598)购自康宁生命科学公司(Corning, NY)。

2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek自动刮伤制作工具: AutoScratch创口制作工具自动在微板中生长的细胞单层中创建可复制的创口。简单的按钮操作和无工具划痕针流形交换使得处理96井或24井板很容易，这通常用于迁移和侵入分析。紧凑的系统具有板载，预先编程的清洁程序，以保持划痕针无细胞积聚和避免污染。AutoScratch使用Agilent BioTek细胞成像多模式读取器和Agilent BioTek Lionheart自动显微镜，精确和高效地自动化样品准备成像工作流程。2022足球世界杯预测2022世界杯附加赛决赛

2022世界杯南美区预选赛 ：Cytation 5是一个模块化的多模微板阅读器结合自动化数字显微镜。基于滤镜和单色仪的微板读数可用，显微镜模块提供高达60倍放大的荧光，亮场，彩色亮场和相位对比。该仪器可以在一个步骤中进行多达四个通道的荧光成像。特别强调活细胞测定，Cytation 5具有震动，温度控制到65°C, CO₂/ O₂由集成的安捷伦BioTek Gen5微板阅读器和成像软件控制，该软件还可以自动进行图像捕获、分析和处理。2022世界杯附加赛决赛该仪器用于利用高对比度亮场或荧光成像通道动态监测细胞迁移。

2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek BioSpa 8全自动培养箱BioSpa 8自动化培养箱将安捷伦BioTek阅读器或成像仪与安捷伦BioTek2022世界杯附加赛决赛洗衣机和分配器连接起来，可实现多达8个微板的完整工作流程自动化。温度、有限公司₂/ O₂湿度水平通过安捷伦BioTek BioSpa软件进行控制和监测，以在所有实验阶段保持理想的细胞培养环境。2022世界杯附加赛决赛测试板在BioSpa中培养，以保持适当的大气条件，为每个测试细胞模型优化适当的时间，并自动转移到Cytation 5进行亮场和荧光成像。

2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek MultiFlo FX多模式分配器: MultiFlo FX是一个模块化的，可升级的试剂分配器，多达两个周围泵(8管分配器)，两个注射器泵分配器和一个带洗衣机。注射器和垫圈歧管可以配置为板密度从6- 384孔。

方法

胶原蛋白板涂层:用0.02 M浓度的醋酸稀释胶原蛋白1:30，最终浓度为33µM。96孔试验板每孔添加50µL体积的稀释胶原蛋白，24孔试验板每孔添加300µL体积的稀释胶原蛋白。钢板在无菌环境中打开，以便液体蒸发和胶原蛋白涂层。

细胞准备:细胞在T-75烧瓶中培养至80%汇合。使用TrypLE从瓶中分离后，根据板孔密度和培养条件，将细胞重悬到预先优化的浓度(表1)。96孔板以100 L的体积为µ，24孔板以1 mL的体积为µ，然后将细胞添加到测试板中。

表1。细胞模型24孔和96孔电镀浓度。

自动刮擦清洗程序:在测试板上绕线之前，对AutoScratch工具销进行清洁和消毒。四种清洗组分被添加到清洗槽的单个容器中，并标记以辅助适当的组分和体积的添加(表2)。最终的Alconox和Virkon-S溶液之前是按照供应商描述的程序制备的。

表2．清洗槽试剂设置。

启动清洁程序。在此过程中，包含引脚的刮擦臂从原位移动到含有0.5% Alconox的储液器中，在y轴上搅拌3秒，然后将引脚浸泡在组件中5分钟。五分钟的潜伏期结束后，机械臂将针移到Virkon-S。然后对其余的每个组件自动重复此过程。在20分钟的清洗周期结束时，针是干净的，无菌的，并准备用于创口。

划伤的产生:清洁过程完成后，测试板被添加到AutoScratch工具甲板，并移除盖子。的刮伤按钮适合所使用的微板密度，24或96他被按下，开始了伤人过程。机械臂将销钉从原来的位置移动到板的第1列，在井的中心垂直处有一个划痕。然后，机械臂将销钉移回装有DI H的蓄水池₂O，并进行三秒钟的搅拌，以去除销上的任何脱臼细胞。然后，销钉自动移动到第2列，对板的每一列重复划痕和清洗步骤。

刮板后清洗:在创面程序完成后，平板被转移到一个单独的层流罩中，其中包含MultiFlo FX，并进行平板清洗程序，以去除从平板底部脱落的细胞。用之前用70%乙醇消毒过的条形清洗机的不锈钢管来吸出介质，蠕动泵和一个蒸压5 μL盒式容器来释放新鲜介质。对于未受抑制的井，该过程重复三次。对于含有细胞松弛素D滴定的孔，在第三次吸入循环后手动添加含有抑制剂的培养基。

基于动力学图像的细胞迁移监测:然后将平板放入BioSpa 8中，之前的大气条件设置为37°C/5% CO₂．水被加到锅里，以创造一个潮湿的环境。BioSpa 8软件的编程使平板自动转移到Cytation 5进行高对比度亮场或高对比度亮场和测试孔的荧光成像，这取决于合并的细胞类型。每个通道都拍摄一张4倍的图像(表3)，以捕捉潜在的细胞移动到原始伤口区域。

表3。包括每个测试单元模型的成像通道。

然后盘子被转移回生物水疗中心8号。根据每个细胞模型的迁移速度，使用优化的迭代来实现动力学成像周期(表4)。

表4。优化每个细胞模型的成像间隔。

图像处理:捕获后，使用表5中的设置，对高对比度的亮场图像进行处理，以增加图像中背景和包含单元格的区域之间的亮场信号的对比度，同时对荧光图像进行处理，以去除背景信号。

表5所示。图像预处理参数

预处理图像的细胞分析:对处理后的图像进行细胞分析，量化每张图像中包含的细胞区域。对于HT-1080单元，使用高对比度亮场通道，以及表6中的标准。

表6所示。HT-1080单元的高对比度基于亮场的对象掩码分析参数。

对于表达RFP的成纤维细胞和表达GFP的U-87细胞，再次使用高对比度亮场通道，标准如表7所示。

表7．U-87和成纤维细胞的高对比度亮场对象掩模分析参数

然而，由于这些细胞也表达荧光信号，除了表8所述的标准外，捕获的RFP或GFP图像也用于进行单独的分析。

表8所示。基于荧光的物体掩模分析参数。

伤口愈合度量计算:然后使用动力学细胞面积覆盖值(物体和面积)生成三个额外的伤口愈合指标，包括伤口宽度、伤口汇合度和最大伤口愈合率。每个指标由Gen5伤口愈合协议自动计算。

伤口宽度

缠绕宽度，即细胞游离区随时间变化的平均宽度，用以下公式计算:

W_t=我_一个-对象和区域_t
我_H

其中W_t是随时间的平均伤口宽度(μm)， I_一个是4x图像的总面积，Object Sum area_t为每个时间点上细胞所覆盖的面积，I_H是一个4x图像的高度。

伤口融合

伤口汇流，即随着时间的推移迁移细胞覆盖原始伤口面积的百分比，用以下公式计算:

C_t=(对象和区域_(t)-对象和区域_（0)) * 100
我_(一)-对象和区域_（0)

其中C_t伤口合流百分比随时间的变化，物体和面积_t单元格在每个时间点所覆盖的面积，对象和面积₀是时间0时被细胞覆盖的面积，I_一个是4x图像的总面积。

最大伤口愈合率

使用Gen5软件中的动力学分析步骤计算最大伤口愈合率。选择Max V计算类型，并使用沿和面积曲线的6个数据点计算速率。用μm表示²每小时。

结果与讨论

在胶原蛋白涂层板内产生划伤

越来越多的出版物表明，细胞外基质涂层孔，细胞附着和相互作用，创造更多在活的有机体内执行时的类环境在体外实验程序。因此，我们使用AutoScratch单元进行了实验，以评估其在附着于之前涂有胶原蛋白ECM的孔的细胞层上持续创建伤口的能力。为了进行评估，HT-1080细胞被镀到96孔或24孔微板的每孔中，使用先前描述的体积和表1中解释的浓度。在经过一夜的孵育后，这些板被放置在甲板上，并使用AutoScratch工具在每口井中创建伤口。如图1A和B所示，对每种钢板类型的高对比度亮场图像进行视觉检查，显示出与非胶原涂层钢板形成的伤口形状和大小相似的一致伤口(图1C)。

图1所示。测试板图像捕获。高对比度亮场图像，4x，从胶原蛋白涂层(A) 96-;(B) 24孔板，以及(C) 96孔非胶原蛋白涂层板，在用AutoScratch创建伤口后立即使用。

为了量化创面形成的一致性，使用表5中描述的参数对高对比度亮场图像(图2A)进行预处理。使用这种方法，包含单元格的图像区域与背景之间的对比度增加了(图2B)。这允许使用表6中的元胞分析标准在包含单元格的区域(图2C)周围准确地放置对象掩码。

图2。高对比度亮场图像处理与分析。(A)原始高对比度亮场图像;(B)预处理后的高对比度亮场图像;(C)经过预处理的高对比度明场图像与物体掩模放置。

使用前面描述的创口宽度公式，生成了96井板和24井板的每口井创口后0时刻的平均创口宽度。涂层胶原蛋白的96孔试验板的所有孔的创面宽度的CV %为1.8%，而涂层胶原蛋白的24孔试验板的创面宽度的CV %为1.5%。当将这些值与使用非胶原蛋白涂层板(96孔格式为2.1%，24孔格式为1.4%)产生的值进行比较时，很明显，当使用AutoScratch工具对未涂层板或在板孔密度中包含ECM时，伤口大小获得了高度的可重复性。

虽然创口的产生与ECM层的存在与否无关，但当允许不受抑制的细胞迁移进行时，观察到一个有趣的现象。如图3所示，HT- 1080细胞镀上胶原蛋白后，伤口在约4.5小时内完全闭合，最大伤口愈合率为2.5x10⁵μm²而镀在非涂层孔上的HT-1080细胞在约6.5小时内实现了伤口完全闭合，最大伤口愈合率为2.0 0x10⁵μm²/小时。

图3。从含有HT-1080细胞的无抑制孔中绘制的平均正负标准差，这些细胞被镀在胶原蛋白涂层或非胶原蛋白涂层表面。

结合高对比度亮场和荧光生成动态伤口愈合指标

为了检查共培养模型中包含的细胞类型的独特迁移模式，通常将表达单独荧光蛋白或用不同荧光探针标记的细胞合并。这允许使用单独的荧光通道监测单个细胞类型(图4)。

伤口愈合试验采用两种表达荧光蛋白的独立细胞类型，U-87 GFP和原代成纤维细胞RFP，以验证使用荧光对迁移细胞进行的细胞分析是否提供了与使用高对比度亮场信号产生的等效数据。U-87细胞被镀在24孔板中，成纤维细胞被镀在96孔板中，细胞浓度如表1所示。在使用AutoScratch和清洗创口后，每个孔中的细胞都被允许不受抑制地迁移回无细胞区。细胞分析使用高对比亮场和U-87细胞的GFP或成纤维细胞的RFP。然后绘制每种分析方法的动力学伤口汇流曲线(图5)。

图4。成纤维细胞和U-87伤口愈合的荧光图像。在(A) 0、(B) 10和(C) 24小时培养后捕获的表达无抑制RFP的成纤维细胞迁移的动力学图像;(D) 0， (E) 10， (F) 24小时后，表达GFP的U-87细胞迁移。细胞被镀在先前涂有I型胶原蛋白的孔中。

图5。平均动力学U-87和成纤维细胞伤口汇流图。使用高对比度亮场和基于荧光分析的无抑制(A) 24孔镀U-87细胞在每个捕获时间点绘制的平均值，正负标准差;和(B) 96孔镀成纤维细胞。

U-87细胞(图5A)或成纤维细胞(图5B)使用高对比度亮场信号或荧光信号产生的动力学伤口汇流曲线的相似性，以及平均最大伤口愈合率之间的相关性(表9)，在这两种细胞类型的95%置信区间，证实了使用高对比度亮场信号或荧光信号的分析产生了相同的结果。

表9所示。U-87和成纤维细胞模型使用高对比度亮场或荧光信号的最大伤口愈合率。

使用共培养细胞模型

举例说明AutoScratch和Gen5的细胞分析用多在活的有机体内样细胞模型，包括癌细胞和基质细胞类型，表达GFP的U-87胶质母细胞瘤细胞和表达RFP的原代成纤维细胞以表1所示的浓度添加到96孔板的孔中。在创面和清洗之后，将细胞松弛素D 8点滴定，范围为10000到2.4 nM，采用1:4的连续滴定，包括无复合阴性对照，分别按平板的每一行添加到4个重复中。然后让细胞不受抑制地或在细胞松弛素D存在的情况下迁移48小时(图6)。

图6。成纤维细胞和U-87共培养伤口愈合的荧光图像。在(A) 0、(B) 18和(C) 48小时培养后，捕获表达RFP的无抑制成纤维细胞和表达GFP的U-87细胞迁移的动力学图像。

然后进行细胞分析以评估每种细胞类型的迁移特性。然而，由于成纤维细胞和U-87细胞都不能在创面的每一侧形成融合的单分子层，因此采用了一种新的分析方法。

在分析步骤中，使用一个图像插头覆盖由AutoScratch创建的伤口左右区域，只留下无细胞区域。通过这种方法，只分析细胞迁移到图像中开放的、未覆盖的区域(图7)。

由于AutoScratch在井与井之间创建的伤口的X轴和y轴坐标的准确性，当应用相同的图像塞时，每个细胞类型在复制井之间生成等价的数据(图8)。

图7。对创面内单个共培养细胞类型的细胞分析。(A)创面后即刻表达RFP的成纤维细胞和表达GFP的U-87细胞的叠加荧光图像。(B) U-87细胞孵育3小时后GFP信号的细胞分析。(C)培养3小时后成纤维细胞RFP信号的细胞分析。

图8．在创建的缠绕曲线中动力学复制汇合。(A)利用U-87 GFP信号在四个重复无抑制井中生成的缠绕汇流曲线。(B)使用来自四个重复无抑制井的成纤维细胞RFP信号生成的缠绕汇流曲线。

然后绘制动力学伤口汇流曲线，以确定共培养细胞模型的细胞迁移模式之间的任何可能差异(图9)。

图9。共培养细胞模型的无抑制细胞迁移曲线。表达GFP的U-87细胞和表达RFP的成纤维细胞的动力学伤口汇合曲线。曲线显示(A) 6小时;(B) 48小时的孵化。

当比较创口后6小时的两种动力学曲线时(图9A)，很明显，U-87胶质母细胞瘤细胞比成纤维细胞有更高的初始迁移率，这表明迁移率较低，特别是在最初4小时。这一点在经过三个小时的孵育后，通过检查物体掩膜面积覆盖的差异得到了证实。共培养细胞模型的无抑制细胞迁移曲线。表达GFP的U-87细胞和表达RFP的成纤维细胞的动力学伤口汇合曲线。曲线显示(A) 6小时;(B) 48小时的孵化。U-87(图7B)和成纤维细胞(图7C)之间。在创面形成后的4至24小时内，两种细胞类型之间的迁移速率变得相当，之后，与U-87细胞在孵育的最后24小时内相比，成纤维细胞的迁移速率再次减慢(图9B)。通过应用图像插头和使用荧光信号进行两种独立的细胞分析，能够识别和仔细检查共同培养的细胞类型之间迁移模式的细微差异，以确定可能的更大的意义在活的有机体内癌细胞转移。

结论

安捷伦B2022世界杯附加赛决赛ioTek AutoScratch创面制造工具能够在96孔和24孔板上自动创建一致的创面，其中包含细胞外基质涂层，如胶原蛋白。验证数据证明，ECM的添加增加了测试细胞类型的迁移能力，而创口的产生不会对测试结果产生不利影响。使用荧光信号的细胞分析技术的加入，还可以评估单个共培养细胞类型的迁移能力，从而创建和适当的评估体内,比如组织和癌细胞模型。

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