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基于ATP消耗的食品新鲜度测定新方法
第2部分:自动化分析的挑战测试

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2014年8月13日,

作者: Wendy Goodrich, BioTek Instruments, Inc.应用部门，Winooski, VT, USA;拉里萨Balakireva,NovoCIB,法国里昂

NovoCIB标志

在这里，我们介绍了对应用自动化和样品制备方法进行挑战测试的结果，并发表在BioTek的应用注释“一种新型新鲜度测定方法的自动化和样品制备优化，测量动物肌肉组织中单磷酸肌苷(IMP)、肌苷(Ino)和次黄嘌呤(Hx)的%比”。[1]．使用多种样品基质，设计实验条件以突出该检测方法作为筛选和分析工具的通用性，这是良好质量控制检测方法的标志。结果表明，这种可靠、快速、易于使用的检测方法在许多应用中都是有效的，可以从鱼新鲜度的非感官量化中受益，如在食品行业典型的良好生产规范(GMP)和HACCP环境中常见的质量保证系统中。

简介

质量保证是一种控制质量的质量管理体系，质量控制对材料的符合性进行监督[２]．根据HACCP(危害分析和关键控制点)的原则，食品工业通常强制实施质量监管标准，从收获或构思到最终消费者购买的整个商品周期。预防性控制是提供HACCP数据的一个工具，例如，通过测试产品腐败或病原体指标，自然或过程污染，或有意或无意掺假参数来确保食品安全。当产品规格制定时，质量方法在研究和开发中也很有用。例如，测试新的防腐技术或包装设计对延长产品保质期的影响可能需要时间过程研究，以评估这些变量对产品新鲜度的影响。然后，这些研究的结果被用于制定生产生命周期后期所需的测试标准，以确保批与批的同质性。

人们普遍认为，一个好的质量方法提供了规范性(分析)和操作性(筛选)的定量或定性的符合要求和适合使用的客观度量。衡量质量方法价值的标准包括可靠性、敏感性、特异性、灵活性和可重复性等因素。对于任何给定的应用程序来说，一个方法都应该是基于性能的、易于使用的，并且有一个实际的结果时间[3]．这些原则为挑战测试的实验设计提供了基础，该自动化工作流模型是根据NovoCIB Precice新鲜度测定的96孔微板改进而开发的[4]．

简单地说，该试验使用专利技术将动物肌肉组织中死后ATP降解过程中产生的3个核苷酸转化为NADH。然后在吸光度340nm处检测NADH。根据K值和Ki值(分别为Saito, Karube)的原理计算每个核苷酸的百分比比率。［5］．单磷酸肌苷(IMP)百分比比率值越高，组织越新鲜。肌苷(Ino)和下沙星氨酸(Hx)的值也被计算出来，除了IMP含量外，还提供了样品新鲜度途径的总体视图。该检测方法设计用于1厘米试管检测，但也应用于96孔微板的基于过滤器的检测。在340nm处检测NADH，自动液体处理，优化样品制备方法以获得更高的通量，BioTek引入并验证了96孔微板格式的检测工作流程选项的多样性。在我们最初的工作中还强调了一个新的Epoch™2微板分光光度计。在其他选项中，Epoch 2具有集成的触摸屏平板电脑，机载线性和轨道震动，以及一个前端装载1厘米的试管端口，特别适合进一步扩大检测的吞吐量选项。

Precision Power XS液体处理机，Epoch Microplate分光光度计和Epoch 2

图1所示。BioTek Precision XS Liquid Handler(左)和Epoch Microplate分光光度计(中)用于验证novvocib Precice®新鲜度检测的自动化和单色检测。Epoch 2(右)也已被验证为测定产生等效的计算结果，并且与测定Gen5样品文件完全兼容。

材料和方法

材料

  • 1升耐热玻璃实验室烧杯
  • 50毫升螺旋帽锥形管
  • BD 10毫升注射器参考309604
  • BioTek 96计数移液管头200 μL(目录号98254;98195)
  • 康宁96孔圆底聚丙烯微孔板(PN 3912)
  • Precice®新鲜度检测产品，NovoCIB PN K0700-003
  • 样品
    • 虾
      • 生虾、冻虾、去皮虾、全虾两种牌子
        • 品牌1 =养殖，进口
        • 品牌2 =野性，美国人
      • 4盎司罐头，野生捕捞，小型北太平洋，预煮(虾，水，盐和柠檬酸)
    • 龙虾
      • 活的北大西洋雌“鸡”龙虾
      • 生的冰冻北大西洋龙虾尾肉
    • 大马哈鱼
      • 4盎司包装烟熏三文鱼，2个品牌
      • 6块寿司，购买日期包装，零售(杂货店)寿司吧
      • 6片刺身，餐厅定制
    • Sartorius Minisart Plus 1.2 μM玻璃过滤器+ 0.2 μM膜28毫米注射器过滤器(PN 17823)
    • 海马12柱聚丙烯储层PN 201256
    • 无菌单刃刀片
    • 8“厨师刀

设备

  • BioTek Epoch™微板分光光度计
  • BioTek Precision™XS微板样品处理器(PPXS)
  • BioTek Gen5™数据分析软件v2.01.14
  • 食品节约v2222真空封口机和夸脱大小的重型密封预切袋
  • 缝匠肌分析天平
  • VWR 320型热板

方法

1.龙虾体积稀释校准与尾、关节、爪肉比较

在无菌条件下，用无菌刀片将23克冷冻的北大西洋龙虾尾肉切碎。将3克样品分成7支50 mL锥形管，用测定提取缓冲液稀释1-7倍。将6ml提取缓冲液仅添加到另一个试管中。根据图2中的工作流程(数据未显示)对样本进行分析。

新鲜的活龙虾在离开水约20分钟后被人道地迅速斩首，其中包括在室温下5分钟，然后在-20°C下冷却15分钟。用一把刚磨过的无菌8英寸厨师刀的尖端垂直切开大脑，然后通过眼柄和眶上棘水平地将甲壳一分为二。从甲壳上切除行走的腿、爪和尾巴，然后从壳上取下关节、爪和尾巴肉，放在冰上，在无菌条件下用无菌刀片切碎(每个基质都要更换)。各取3克置于50 mL锥形管中，用测定提取缓冲液稀释3倍。3克冰冻龙虾尾末也以相同体积稀释作为对照。根据图2中的工作流程分析样本。结果如图3所示。

用于检测样本肌肉组织中IMP(蓝色)，Hx(红色)和Ino(绿色)的自动化分析流程和板图。

图2。用于检测样本肌肉组织中IMP(蓝色)，Hx(红色)和Ino(绿色)的自动化分析流程和板图。

2.贮藏条件对保鲜指数的影响

将25克冷冻和新鲜屠宰的龙虾尾肉、虾罐头和生的冷冻全虾进行真空密封，贴上标签，每组4个样品置于5种存储条件(-80°C、-20°C、0-4°C、0-4°C冰上或室温(RT))中的一种。在0-4°C结冰条件下，样品被部分覆盖在每天更换的刨冰中。从每个基质中抽取的第5组样品立即测试第1天的结果。龙虾样品被取出，并在24小时和72小时的3倍体积稀释萃取缓冲液中进行测试。在10天的时间里，每48小时取出罐头和冷冻虾，在2倍体积稀释的提取缓冲液中进行测试。所有样本都使用图2中的工作流程进行分析。计算每个时间点之间的变化百分比，最后的变化百分比计算为第一个时间点和最后一个时间点之间的相对含量的增量，除以第一个时间点，再乘以100。结果如图4所示。

3.品牌和母体比较-烟熏三文鱼，寿司/刺身

将来自2个不同品牌的5片烟熏鲑鱼切碎，分成3克批次，然后使用图2中的工作流程在5倍体积稀释试剂盒提取缓冲液中进行检测。两个品牌的“销售截止日期”对应的是测试之日起9天。标记1在1-5列的检测板上运行，标记2在6-10列的检测板上运行。结果如图5所示。

将三文鱼寿司和生鱼片各5块切碎，分成3克批次，然后使用图2中的工作流程在5倍稀释试剂盒提取缓冲液中进行检测。零售寿司是预先包装的“使用日期”对应的购买和测试后的一天。餐厅的生鱼片是在同一天订购、购买和测试的。寿司在第1-5列的检测板上运行，刺身在第6-10列的检测板上运行。结果如图6所示。

结果与讨论

图3显示了新鲜屠宰和冷冻龙虾的IMP水平结果。冷冻龙虾尾的连续稀释的最佳稀释体积为3倍，用于我们的挑战测试。序列稀释的结果没有显示，因为建议所有样品基质的体积稀释都由NovoCIB预先校准。新鲜屠宰的龙虾尾巴、关节和爪组织显示了类似的结果，这表明关节或爪肉可以取代尾部肉来测试新鲜度水平，为最终产品保留高价值的尾部肉。新鲜宰杀的龙虾的三种组织样本中所含的IMP含量都低于冷冻的龙虾尾肉。假设从屠宰到测试之间的1小时时间间隔对于ATP的酶促转化达到最佳的IMP水平来说太低了。这一点通过在3个时间点和3种储存条件下对尾肉的重新测试得到了证实。结果表明，在0 ~ 4℃冷冻24 h、0 ~ 4℃冷冻72 h可获得最佳的IMP水平，在0 ~ 4℃冷冻24 ~ 72 h可达到与冷冻龙虾尾相当的IMP水平。当组织在0-4°C保存72小时时，Hx水平达到峰值，这表明未煮熟的鲜宰龙虾尾肉应在24小时内食用，在该保存条件下，2天后会迅速变质。

宰前和宰后的压力源也可能在ATP向IMP的转换速度中发挥作用，包括在这种情况下，龙虾离开盐水浴的时间，在什么条件下宰前保存，以及在样品制备过程中使用的任何冷却条件。

新鲜屠宰的龙虾尾、龙虾关节和龙虾爪肉与冷冻的龙虾尾进行了比较

图3。新鲜屠宰的龙虾尾、龙虾关节和龙虾爪肉与冷冻的龙虾尾进行了比较(上)。新鲜宰杀的龙虾中IMP水平低的假设是由于屠宰和检测之间的时间很短(1_RT)低于ATP对IMP的酶降解窗口。样品在3个存储条件和时间点重新测试，以测试这种可能性(下)。

图4显示了核苷酸在5种存储条件下百分比变化的结果。数据显示了超过72小时(龙虾)或10天(虾)的3个时间点。正如预期的那样，冷冻龙虾尾在-80℃或-20℃保存时变化很小，但在0-4℃或RT保存时迅速降解(Hx水平增加450%)。新鲜宰杀的龙虾在0-4°C冰冻72小时后，IMP含量增加近300%。相反，当储存在0-4℃或RT时，在同一时间段内Hx水平增加90-100%，它开始死亡。冷冻任何一种龙虾组织似乎都能保存所检测到的所有核苷酸的水平，变化百分比非常小。虾罐头是预先煮熟并用柠檬酸保存的。尽管在所有储存条件下Hx都是最稳定的，但在10天的测试期内，Hx水平的增加表明，罐头虾的新鲜度水平可以在打开后在-20°C冷冻，但在所有其他条件下，即使在0-4°C保存，也会在10天内开始下降。生冻虾在购买后的78 - 88天内进行检测(“最佳时间”是购买后的6个月)，这可能解释了在此期间Hx水平的上升。根据该产品的推荐，结果表明，当在室温或0-4℃存储时，虾的IMP水平开始下降，Hx水平上升，应将其冷冻以获得最佳的新鲜水平。

保存条件对鲜宰龙虾尾相对核苷酸含量影响的代表性结果

图4。贮藏条件对鲜宰龙虾尾、冷冻龙虾尾、罐头虾和冷冻虾相对核苷酸含量影响的代表性结果。

图5和图6分别显示了两个品牌的烟熏三文鱼和两种不同来源的寿司/刺身的新鲜度。烟熏鲑鱼表现出类似的特征，低水平的IMP可能有助于该产品独特的味道和质地特征。与两种基质的其余样品相比，有一块生鱼片被检测为离群值。尽管所有的寿司和生鱼片在美国市场销售时都必须预先冷冻，但不同的年龄或解冻条件可能会导致新鲜度的差异。寿司和生鱼片中较低的IMP水平可能表明，预冷冻组织可能有助于加快ATP降解途径的速度，导致较低的IMP水平，典型的是较长的存储时间，反映出鱼是不新鲜的。

两种烟熏三文鱼相对核苷酸含量的比较。

图5。两种烟熏三文鱼相对核苷酸含量的比较。

两个来源的寿司和刺身的核苷酸比较(左)。试验控制在预期的分析性能范围内

图6。两个来源的寿司和刺身的核苷酸比较(左)。试验控制在预期的分析性能范围内[6]．

结论

使用各种样品矩阵和实验条件的挑战测试数据表明，BioTek仪器和novvocib Precice®新鲜度分析的组合为许多食品质量控制或研究环境中典型的各种海鲜新鲜度测试需求提供了一个有效的筛选和分析工具。

参考文献

(1, 4, 6)Goodrich, Wendy, Balikireva, Larissa，测量动物肌肉组织中一磷酸肌苷(IMP)，肌苷(Ino)和次黄嘌呤(Hx)百分比的新新鲜度测定方法的自动化和样品制备优化，BioTek仪器公司。应用注意，食品安全和质量，//www.aspinnursery.com/ resources/app_notes.html, 20142022卡塔尔世界杯完整赛程。

(2、3)质量管理体系基础和词汇http://www.qualitygurus。net/

［5］鲜鱼的品质和品质变化。粮农组织企业文件库，1995年。http://www.fao.org/docrep/v7180e/v7180e00.htm

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