基于ATP消耗的食品新鲜度测定新方法
第1部分:自动化和样品准备优化

作者: Wendy Goodrich, BioTek Instruments, Inc.应用部门，Winooski, VT, USA;拉里萨Balakireva,NovoCIB,法国里昂

基于ATP(三磷酸腺苷)死后降解途径中形成的乐鱼平台入口产物的检测，一种新的混合和read检测方法被开发用于测定动物组织中的新鲜度。肌苷单磷酸(IMP)，肌苷(Ino)和次黄嘌呤(Hx)从样本组织中提取，然后使用专用酶试剂转化为NADH。以百分率值表示，通过在340 nm处检测NADH，可以计算核苷酸的相对含量。在第一项研究中，对有助于提高新鲜度检测工作流程或吞吐量的检测方法的自动化和非自动化性能参数进行了比较评估，包括仪器参数和样品制备选项。数据包括精密度、准确度、线性、测定间和测定内重复性以及灵敏度(如适用)。正如附带的应用说明中所报道的那样，使用多种样品基质和实验条件进行了分析挑战测试，并应用了本文开发的自动化和样品制备方法。^[1]这种检测方法作为一种快速、简单、无感觉、上游的多用途鱼类组织基质新鲜度量化方法具有广泛的用途，例如，作为一种计算货架寿命指标的方法，如图所示，通过对生的冷冻虾进行3个月的时间过程。

简介

三磷酸腺苷(ATP)是一种核苷，由一个核糖环和一个附着的腺苷基和明显的三磷酸氢键组成。在其他重要的生物功能中，ATP在肌肉收缩中起着重要作用，是细胞呼吸的最终产物。当细胞活性停止时，通过自溶酶和细菌的联合作用，ATP自然耗尽，三磷酸氢和腺苷键减少，依次将ATP降解为更小的核苷和嘌呤最终产物腺苷二磷酸(ADP)、腺苷一磷酸(AMP)、肌苷一磷酸(IMP)、肌苷(Ino)和次黄嘌呤(Hx)(图1)。乐鱼平台入口^[２]由于这些分解代谢产物是在死后早期产生的，它们在动物组织中的测量可用于确定质量控制参数，如肌肉年龄和储存时间，这是新鲜度的重要指标。这些核苷酸在组织产物中的数量也可以影响感官属性，如味道和质地。乐鱼平台入口

图1所示。新鲜途径的生化结构特征为ATP消耗到次黄嘌呤(Hx)后的细胞呼吸在死后肌肉组织。

1959年，日本Saito等人首次用一个包含所有新鲜途径产物的6参数方程来量化鱼组织的新鲜度，并将其表示为k值。乐鱼平台入口k值越低，鱼越新鲜。该方程后来被Karube等人在1984年简化为仅对IMP、Ino和Hx的Ki(%) 3参数方程。^[3]%IMP和%Hx可以用Ki的关系表示为一个等价的新鲜指数，即%IMP越高，鱼越新鲜。这种关系如图2所示，图中还显示了这些核苷酸的分解速率和浓度随时间的变化是物种相关的。

图2。在死后早期的一段时间内，肌肉组织中存在最高水平的单磷酸肌苷(IMP)，并与次黄嘌呤(Hx)的增加成反比。这一剖面因物种而异，如鳟鱼(左)、鲭鱼(中)和比目鱼(右)。

除了感官质量控制方法，由训练有素的评估人员进行主观测量，还有生化和化学方法定量评估海鲜的新鲜度。这些包括在测试条上的固定化酶，酶包覆氧电极，耦合酶仪，显色和色谱分析，如高效液相色谱等。有些方法与肌肉组织的种类或预先烹饪或罐头等工艺变量不相容，另一些方法只在死后后期阶段(>=死后10天或更长时间)有用，或包括由熟练人员使用的昂贵设备和更复杂的技术，这些技术与较小的现场或现场实验室不协调。一般认为，最相关的数据来自方法的组合，或方法中的目标。^[4]例如，如果从样品提取中计算出IMP的相对含量为50%，它就不能表明IMP是生成的还是消耗的，这一点可以通过知道随后的Ino和Hx的百分比来澄清。

为了解决这些问题，法国公司NovoCIB于2012年1月推出了一种新的酶促检测方法Precice®新鲜度检测(图3)。

图3。NovoCIB Precice®新鲜度检测原理和工作流程。该测定法在一个固定的96孔微孔板格式中对最多11个样品进行3次测定，第12列保留为预填充标准(左上)。(%) IMP， (%) Hx和(%)Ino的相对含量在核苷酸酶促转化为NADH后计算，并在340 nm处检测NADH(左下和右下)。

在引入这种检测方法之前，还没有方法可以测量虾、龙虾或罐头鱼中的IMP、Ino或Hx。由于核苷酸具有热稳定性，因此几乎可以对任何物种进行热稳定性测试，包括未冷冻的生的、以前冷冻过的、冷冻包装的、“冰上”的、烟熏的、预先煮好的、准备好的、鱼罐头或其他肉制品(包括虾和龙虾)。混合和读取格式结合了快速、客观的上游新鲜度量化指数和易于使用，允许内部测试作为色谱方法的一个选项。作为筛选工具，它可以在总挥发性碱性胺(TVB)、三甲基胺(TMA)或生物胺(BA)等方法成为相关方法之前确定质量指标的结果。这种多功能性可以应用于在96孔微板上使用相同的样品制备方法测试多达11个重复的单个样品。这种方法的一致性允许引入微板自动化，可以提供改进的分析工作流程，吞吐量和重复性的手工程序(图4)。

图4。BioTek Precision Power XS Liquid Handler(左)和Epoch Microplate分光光度计(中)用于验证novvocib Precice®新鲜度检测的自动化和单色检测。Epoch 2(右)也已被验证为测定产生等效的计算结果，并且与测定Gen5样品文件完全兼容。

最初设计使用基于过滤器的检测方法，在这里，我们使用BioTek的Epoch™在340 nm处验证了NADH的单色检测，包括BioTek Epoch阅读器家族(Epoch和Epoch 2)的数据可比性。低成本的Epoch阅读器家族提供了一个小的工作台占地面积，与更小的室内或现场实验室很好地配置。Epoch还具有光谱扫描的优势，可以可视化NADH峰在340 nm处。此外，动态读取模式提供了检测核苷酸随时间向NADH的酶促转化的选项。Epoch 2产品线提供了增强的功能，如线性和轨道震动和一个前加载垂直试管支架，有利于Precice新鲜度分析工作流程选项。

BioTek Gen5™软件的安全特性用于控制Epoch阅读器系列，使方法易于标准化，并提供用户和仪器活动的时间戳审计跟踪，一些版本提供21 CFR Part 11合规。Epoch阅读器家族还可以与液体处理程序和机器人集成，以增加筛选更多样本的吞吐量能力。作为一个例子，这里演示了使用BioTek的Precision™XS微板样品处理器(PPXS)自动化该试验的液体处理过程的潜在工作流和吞吐量解决方案。使用NADH标准和酶稀释法对仪器进行了多次验证。然后评估样品制备选项对工作流效率和结果优化的贡献。最后，将选择方法应用于冷冻虾的时间历程研究中，观察储藏时间对3个月时间内6个点核苷含量的影响。

材料和方法

材料

• 1升耐热玻璃实验室烧杯
• 50毫升螺帽锥形管
• BD 10毫升注射器参考309604
• BioTek 96计数移液管头200 μL(目录号98254;98195)
• X牌进口生、冻、去皮、全虾(零售)
• 含b -烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)还原形式的新鲜度测定试剂盒(NovoCIB PN K0700-001)的校准溶液[CAS 53-84- 9, C₁₂H₂₇N₇阿,₁₄P₂］
• 康宁150毫升瓶顶过滤器聚苯乙烯PN 431161
• 康宁Costar聚苯乙烯96孔圆底微板(PN 3797)
• 康宁96孔圆底聚丙烯微孔板(PN 3912)
• Millipore 50 mL Steriflip Cat No.;SE1M003M00•Pall Acrodisc注射器过滤器0.2 μM 25 mm (pn4192)
• Pall GHP Acrodisc GF, GF/0.45 μm, 25 mm (pn4559)
• 氢氧化钾Sigma P-1767 (CAS 1310-58-3, KOH)
• Precice®新鲜度检测产品，NovoCIB PN K0700-003
• Sartorius Minisart Plus 1.2 μM玻璃过滤器+ 0.2 μM膜28毫米注射器过滤器(PN 17823)
• 海马聚丙烯12柱储层PN 201256
• 无菌单刃刀片

设备

• BioTek Epoch™微板分光光度计
• BioTek Precision™XS微板样品处理器(PPXS)
• BioTek Synergy™H4混合式多模式微板阅读器
• BioTek Synergy™HT多模微板阅读器
• BioTek Synergy™Neo HTS多模微板阅读器
• BioTek Gen5™数据分析软件v2.01.14
• 离心50毫升管兼容12,000 rpm或更大
• OMNI GLH，通用实验室均质机，带硬组织OMNI针尖™塑料发生器探头
• 真空泵
• VWR 320型热板

方法

1.使用NADH标准的单色仪检测和自动液体处理的验证

NovoCIB在10 mM KOH中提供了1 mL 13种标准的NADH，分别为0、12、27、100、125、150、204、245、305、395、480、610和725 μM。将0.0129 gr KOH重组到20.260 mL MilliQ水中，得到10 mM KOH。将725 μM标准品稀释13倍，制成55 μM标准品。先将每种NADH标准量230 μL，一份一份地分配到2个支撑板(Corning)，制备标准曲线。在培养皿中添加8个重复的NovoCIB和BioTek空白(10 mM KOH)。一个支撑板，一个96计数的200 μL移液头盒(BioTek, 98254)和一个圆底96孔微孔板(Costar)加载到PPXS上。第二个支撑板用于手动移液。对于每个标准品，使用8通道移液管将两个100 μL的液液从保留板转移到分析板(Costar)的A04-H09孔，标准品采用2 × 8格式，空白品采用1 × 8格式，每列后更换针尖。除了Epoch™微板分光光度计还包括从300到400纳米以10纳米增量的光谱扫描以外，两个板都在单色模式下的四个BioTek微板阅读器上在340纳米的单色模式下读取。NADH标准曲线法在两天内重复两次，结果在制备的标准体积允许的情况下，2次运行4个板。 Data was blanked on the average of the zero standards. The replicates of 10 mM KOH were used to calculate Limit of Blank (LoB). Standards were plotted using a linear curve fit, and precision, accuracy, Limit of Detection (LoD) and Limit of Quantification (LoQ) calculated. Accuracy was calculated by weighing each assay plate (Costar) pre- and post-dispensing then taking the delta weight.

每口井的实际体积是通过delta除以板上分配的井的总数，然后乘以1000来确定的。准确率百分比用实际:预期体积乘以100的比率表示。谱分析采用0 ~ 150 μM标准谱图。绘制Epoch的标准曲线数据，并与基于竞争对手过滤器的微板读取器、基于竞争对手过滤器的比色管分光光度计、其他BioTek单色仪和NADH供应商定义的预期臭氧消耗(ODs)进行比较。

2.利用检测试剂进行液体自动处理优化

以试剂盒提取缓冲液为样品和稀释剂，3次稀释(1:1,1:2,1:10)的酶试剂，共6个平板，3次运行。每次运行2个平板，两名操作人员按照包装上的说明平行制备检测试剂盒试剂，每种试剂2.8 mL(3种酶混合物和一个反应缓冲液)，以及1 L提取缓冲液/试剂盒。1 mL萃取缓冲液和1 mL每种制备的试剂加入4个50 mL锥形管(Eppendorf)，得到2 mL 4倍稀释。将1.8 mL萃取缓冲液放入另外4个5ml锥形管中，然后分别加入200 μL的每种试剂，得到2 mL的1:10稀释溶液。其余试剂用于1倍稀释。每个操作人员将每种稀释剂的230 μL/孔分配到容纳板(康宁)的4孔(共8孔/趟)，然后将5ml提取缓冲液加载到12通道试剂库(海马)的3通道(共6通道)。手动从12通道试剂库中提取100 μL/孔的萃取缓冲液到空板的7-12列中。然后将分析板、保持板、12通道储液器和2盒96计数移液管头装载到Precision™XS微板样品处理器。在色谱柱之间更换尖端，自动分配提取缓冲液至col1 -6，试剂至col1 -3和7-9的每个检测板。从Precision XS微板样品处理机中取出检测板和固定板，手动将100 μL剩余试剂从固定板中分配到检测板的4-6和10-12 coll。 Plates were then read kinetically every minute for 1 hour at 340 using Epoch Microplate Spectrophotomer controlled by Gen5™ Data Analysis Software. Mean, standard deviation, and CV% were calculated for each dilution and each method within and between all 3 runs. Workflow was edited to allow continuous throughput for 1 up to ‘n’ plates in final assay mode. Workflow validation was achieved by calculating % error (100% - % accuracy) from a mock run of 6 plates using 200 μL/well of assay extraction buffer.

3.样品制备方法优化

在单一批次的“X”牌虾上评估和验证了最佳样品准备工作流程参数。将80克样品无菌切碎，混合，称量，放入4个50ml锥形管中的一个，然后用试剂盒提取缓冲液1:2稀释(18gr:36mL)。两个样品均质45秒，速度为4，加入切碎的虾，然后盖住所有四个样品，煮沸20分钟，然后冷却。另外两个样品在12,000的温度下每隔5分钟离心，每隔5分钟将渗出液转移到一个干净的50ml锥形管中，直到没有球团形成。另外两个样品分别使用真空驱动瓶顶过滤器(Corning)或0.2 μm膜注射器过滤器(Pall)进行过滤。每个样品取100 μL，每个核苷酸重复4次。其余的试验按照试剂盒说明进行。在其他三个样品上重复这一过程，未进行均质或离心，但使用2步真空过滤系统(Millipore)、GF/0.45 μM 25 mm注射器过滤器(Pall)或GF/0.2 μM膜28 mm注射器过滤器(Sartorius)进行澄清。分析了每种澄清方法的样品回收量、材料和步骤数。选择方法被切碎,然后验证池、品牌“X”,重25克虾在购买日期后45天,放置4 gr在每四个50毫升锥形管,增加8,16日,32岁和40毫升(2 X 4 X 8 X, 10倍稀释)提取的缓冲区,限制管,煮20分钟,冷却样品在冰上5分钟,恢复提取使用注射器过滤(缝匠肌),然后分析样品在复制每包插入每个核苷酸的6。 A pre-calibrated optimal dilution factor (2x) for shrimp (calculated by NovoCIB) was reproduced by running a 10 point serial volume dilution on a single 18 gram weight of minced, Brand ‘X’ shrimp at 68 days post purchase date diluted 1x in extraction buffer, boiled 20 minutes, then cooled on ice 5 minutes. 10 mL of 1x sample was filtered (BD, Sartorius) into a 15 mL conical tube as a starting standard. Two ¼ log dilutions were performed from 6 mL of start volume, followed by seven ½ log dilutions on each subsequent standard using extraction buffer. A zero standard was composed of filtered assay buffers only. Standards were transferred to the assay plate in duplicate for each nucleotide and NADH detected according to the kit insert (data not shown).

4.应用自动化和单色检测“，

方法2和3中优化的自动化和样品准备工作流程参数应用于购买日后的6个时间点(第0天、第45天、第68天、第78天、第82天和第88天)，使用2批次试剂盒试剂(第0和45时间用第1批次试剂测试，第68、78、82和88天用第2批次试剂测试)测试品牌“X”虾。在每个时间点，根据试剂盒说明书制备1升解冻提取缓冲液。30克虾被无菌切碎，混合，称重成两个15克的批次。每个批次放入50毫升锥形管中，用提取缓冲液稀释2倍(15gr:30mL)，盖上盖子，煮沸20分钟，然后在冰上冷却5分钟。当样品煮沸时，根据试剂盒说明书制备解冻的检测试剂。2 mL提取缓冲液装入12通道试剂库(海马)的第12通道，用于测定标准的重建。将330 μL/孔的反应缓冲液(A、B行)和酶混合物1、2、3 (C-H行)分别装入试剂保存板(Corning)的A01-H04孔。每管取30毫升样品提取液倒入100毫升烧杯中。5ml混合样品吸入10ml一次性注射器(BD)。注射器装有多层圆盘过滤器(Sartorius)，样品被直接分配到12通道水库的第1道。 This was repeated 10 additional times for a total of 11 replicates. The reagent holding plate, sample reservoir vessel, an assay plate (NovoCIB), and 2 boxes of 96-count 200 μL tips were placed on the Precision XS Microplate Sample Processor supply deck. The Precision XS transferred 100 μL/well of each sample from lanes 1-12 of the sample reservoir to columns 1-12 of the assay plate respectively using the multichannel pipette, changing tips between each transfer. Again using the multi-channel pipette, the Precision XS transferred 100 μL/well from column 1 of the reagent holding plate to columns 1-3 of the assay, repeating for columns 2-4 of the holding plate to columns 4-12 of the assay plate respectively, changing tips after each transfer. The assay plate was removed from the Precision XS supply deck, shaken for 2 minutes, and read kinetically for 1 hour at 1 minute intervals at 340 nm on Epoch. Using Gen5 Data Analysis Software, the mean of each blank pair (see Figure 3 for the assay map) was subtracted from all wells in a column, followed by calculation of %IMP, %Hx, and %Ino. Using GraphPad Prism, a gaussian frequency distribution illustrating expected assay performance was plotted on blanks and standards from all experiments that were automated. LoB, LoD, and LoQ were calculated and compared to the same values obtained from the NADH standards run in Method 1. LoQ percent error was calculated as the sum of instrument bias (1% from 0-2.0 OD), imprecision (average precision (CV)), and total error (mean OD was used as the expected value) using raw ODs of blanks and NCs.

结果与讨论

图5和图6显示了单色仪和基于过滤的检测方法在0-610和0-725 μM NADH的线性比较结果，以及自动移液与手工移液的精度和准确性。值得注意的是，分析内和分析间精密度均<2%，自动化方法的分析间精密度δ为0.452%。尽管手工方法的平均准确率更高，但在不同版块之间的准确率差异是自动方法的12倍。光谱扫描数据表明，NADH在340 nm处的检测峰值明显，即使在12-150 μM标准与空白(0 μM)相比浓度较低的情况下，手动和自动移液之间也存在紧密的相关性。尽管试管检测的高端动态范围不同，但检测方法之间的线性关系从100 - 395 μM的NADH (0.5 <=OD <=1.8 OD)与非试管检测方法的动态范围增加到>1.8 OD (>400 μM NADH)之间是相关的，这由亚历元微板分光光度计的数据表示(也见文档最后的表4)。

图5。比较竞争检测方法之间0-600 μM NADH的线性(上)，比较同一仪器家族的单色仪之间0-725 μM NADH的线性(下，BioTek Synergy线)。左边的插图放大了0-55 μM的结果，说明了不同方法下料的差异。右侧，通过单色仪检测NADH在所有阅读器上的线性范围为0.5 <=OD <= 2.5 (>50 - 610 μM)。

图6．使用BioTek的Epoch™单色仪检测0-725 μM NADH标准自动移液与手动移液的精度和准确性(上)。即使在低浓度下，也可以通过Epoch光谱扫描分析(底部，(A)自动，(M)年)在340 nm处看到NADH的明显峰值，如图12-150 μM相比于0 μM(每个点n=4)所示。

表1显示了使用检测试剂稀释的自动液体处理与手工处理的检测间精密度。尽管自动移液的可变性要高出1.548 CV%的增量，但手动移液的异常值要高出4倍。自动化方法上的异常值是由于实验设计导致的试剂容量不足，并且在试剂容器装载过程中可以看到。对于手动方法，这可能是由于观察到的8通道手持移液器试剂体积要求较高，导致最后一次分配的试剂体积少于所需的试剂体积，或操作人员缺乏准备试剂保存容器体积的经验。

表1。方法2描述的自动液体处理验证的测定间精度。结果反映了6个培养皿每种稀释条件下所有试剂的平均值。

一个最终的连续液体处理吞吐量模型被优化以实时运行检测，表2显示试剂的使用是充分的，通过消除6个平板模拟吞吐量运行产生的异常值显示。

表2。模拟6板运行自动化工作流挑战测试的准确性结果。PPXS对精度的规范是每50 - 100 μL分配误差<=2%。两个100 μL配制的预期累积%误差<=4%。

图7-9和表3显示了优化分析样品制备流程的澄清步骤的代表性结果。离心和均质样品导致核苷酸的高回收率，但只有在重复循环之后(图7)。

图7。分析样品制备过程中不同澄清方法的结果比较。尽管NHC样品显示出最高的核苷酸回收率，但在没有组织颗粒之前，它们需要5个离心循环和渗出液转移。(F)过滤后的样品必须分批成小体积，然后使用0.20 μM 25 mm注射器反复过滤，然后再汇集足够的澄清样品以运行试验。

注射器过滤所需的步骤和设备数量最少，但在膜和圆盘尺寸选择的单膜注射器和真空方法导致低甚至没有样品回收率取决于浓度(一些数据没有显示)。一种过滤方法包括一个配有多层28毫米圆盘(BD, Sartorius)的10ml注射器，可以在最大的浓度范围内以最小的孔径快速回收最多的样品，并且只需要一个澄清步骤，不需要额外的设备(表3)。

表3。样品萃取物在不同浓度下的回收率比较过滤方法的代表性结果。

该方法在3种浓度的样品上进行了测试(图8)，最终确定了最佳的样品准备工作流程(图9)。

图8。最终过滤方法的验证(10ml注射器装有GF+0.2 μM过滤盘(BD, Sartorius))，使用3次稀释样品。在较低浓度的样品中，有效核苷酸含量略有下降，但在预期范围内，这表明即使在较高浓度的样品中，过滤方法也能有效地回收样品，核苷检测受稀释因子的影响更大。2倍(4:8，上图)是NovoCIB测定的测定虾的最佳稀释因子。

图9．最终优化的工作流程。新鲜度值方程嵌入到Gen5™样本文件中。

图10说明了“X”牌生冻虾的新鲜度概况。在产品新鲜度的这一阶段，肌苷(Ino)的抛物线位移反映了分解动态，因为随着时间的推移，组织中的IMP被耗尽，Hx形成。

图10．对生虾、整虾、去皮虾、进口虾、养殖虾、冷冻虾3个月的新鲜度路径进行量化，说明IMP分解为Ino，继而分解为Hx。该产品有“最佳使用日期”标签，对应于购买之日起6个月(180天)。

表4比较了10 mM KOH中NADH标准的LoB、LoD和LoQ以及线性和动态范围，与6个月期间13次和9次独立自动运行的检测试剂计算的结果进行了比较。

表4。空白限(LoB)，检测限(LoD)，定量限(LoQ)，以及Epoch单色仪检测NADH标准物(0 - 725 μM)和检测试剂的线性和动态范围的结果。LoB、LoD和LoQ的计算采用临床实验室标准协会协议EP17-A中的方法。^［5］

图11反映了使用自动液体处理和/或单色检测的检测方法的预期性能范围。由于阳性对照被预先装载在检测板中，每个核苷酸只有1个阳性对照的重复。在实验条件允许的情况下，坯料和阴性标准品可在>1重复中进行试验。第一批空白和nc不包括，因为由套件分发者更换了板。由于阳性对照的计数较低，次要y轴被调暗以保持视觉连续性。Epoch™的光谱扫描功能可以用于区分NADH检测和边缘样品可能的检测试剂背景(图6)。

图11。使用自动液体处理和单色检测的测定性能预期范围。绘制原始空白值。标准值(NC,PC)为空白。空白和阴性控件使用左边y轴上的计数，而阳性控件使用中间y轴上的计数(为了视觉连续性而调暗)。

结论

我们的验证数据表明，novvocib Precice®新鲜度检测适用于BioTek自动液体处理仪器和96孔微板格式的340 nm NADH单色检测，提供标准的操作程序效率和多样化的工作流程，吞吐量和大多数实验室环境中的检测选项。

参考文献

Goodrich, Wendy, Balakireva, Larissa，挑战一种自动、新颖的新鲜度测定方法的测试，测量动物肌肉组织中肌苷单磷酸(IMP)、肌苷(Ino)和次黄嘌呤(Hx)的%比率，BioTek仪器公司。应用说明，食品安全和质量，2014。//www.aspinnursery.com/资2022卡塔尔世界杯完整赛程源/ app_notes.html

[2,3,4]王晓峰，王晓峰，等。鲜鱼品质的变化。粮农组织企业文件库，1995年。http://www.fao.org/docrep/v7180e/v7180e00.htm

[5] Tholen, Daniel W. m.s.， CLSI EP17A检测限度和定量限度的确定协议;经批准的指南，EP17-A标准由临床和实验室标准协会于2004年10月20日发布。第二版目前正在印刷:皮尔森-佩里，詹姆斯F.等。CLSI EP17-A2检测限和定量限测定方案批准指南-第二版，EP17A2E标准由临床和实验室标准协会于2012年1月6日发布