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一种基于均相微扰的HTS定量分析癌症细胞系中pRb以监测G0/ G1细胞相变

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2020年4月21日

箭头相关样本文件:HTRF RB剂量反应- hct116

作者: Peter J. Brescia，应用科学家，BioTek Instruments, Inc.， Winooski, VT

摘要

癌症生物学领域仍然是工业和学术界最迅速发展的研究领域之一。了解导致肿瘤进展失控的控制通路和检查点的中断是了解疾病进展的关键。本文提出了一种新的基于htf细胞的检测方法，它可以量化内源性磷酸化的视网膜母细胞瘤蛋白作为G0/ G1细胞相变。

简介

鉴于每年报告的大量新病例，癌症仍然是一个全球关注的问题。在分子水平上理解疾病进展的基础生物学方面的最新进展已被证明有利于识别抗肿瘤细胞生长的新靶点和新制剂1．一般来说，癌症进展的一个关键因素是破坏细胞周期控制，导致细胞无阻碍地增殖。识别控制途径和目标检查点的能力可能通过新疗法提供干预点2．

在正常的细胞周期控制中，细胞周期的不同阶段是保守的，从G0(沉默)后面跟着G1(pre-DNA合成)，S (DNA合成)，G2(预分裂)和M(细胞分裂)。其中，从G1通过细胞周期蛋白依赖激酶(CDKs)和细胞周期蛋白之间的相互作用，向S提供了一个抑制细胞增殖的哨兵点3.．CDKs亚群丝氨酸/苏氨酸激酶的一个关键作用是视网膜母细胞瘤(Rb)基因产物pRb的过度磷酸化，在G早期1通过CDK4和CDK6与细胞周期蛋白D1相互作用导致失活，随后释放大量进入S期所需的转录因子4．先前的观察表明，抑制CDK4/6可能阻止肿瘤生长，并可能帮助细胞恢复到接近正常的表型2．

本文展示了一种新的基于htf细胞的检测方法，该方法简单而准确地定量了内源性磷酸化的视网膜母细胞瘤蛋白Ser807/811作为G0/ G1细胞相变。剂量反应和IC50采用高通量384孔，均质细胞为基础的检测格式，使用代表性癌细胞系确定代表性激酶抑制剂的浓度。

HTRF®检测。

图1．HTRF®检测。HTRF接近性分析依赖于两种针对磷酸化Rb的不同特异性抗体。一种抗体用隐酸铕(供体)标记，另一种抗体用受体标记。当标记抗体靠近时，就可以检测到FRET信号。

材料与方法

HTRF读取器对照试剂盒(PN: 62RCLPEA)、人TNF α试剂盒(PN:62HTNFAPET)和Phosph- Rb (Ser807/811)细胞试剂盒(63ADK105PEG)均来自Cisbio公司(Bedford, MA, USA)。按照制造商推荐的标准组织培养方法培养HCT116 (PN: ATCC®CCL-247™，ATCC, Manassas, MD, USA)细胞。磷Rb试验采用单板试验方案进行。简单地说，使用TrypLE分离试剂(PN:12605036, Thermo Fisher, Waltham, MA, USA)在80-90%的汇合度下收集细胞，并进行温和处理。通过离心收集细胞，在适当的生长培养基中以所需的细胞密度重悬，然后以8 μL的浓度将10000个细胞注入一个384孔的小体积白色微板(PN:3826, Corning, Tewksbury, MA, USA)，并在37°C, 5% CO孵育期间吸附2过夜。

Palbociclib (PN: 4786, Tocris, Minneapolis, MN, USA)作为半对数稀释系列制备3倍原液，加入体积为4 μL的适当细胞生长培养基，与上述混合，孵育6小时。按生产厂家的推荐配制裂解试剂，加入量为4 μL，搅拌1小时。抗体预混合液按照制造商推荐的单板方案制备。加入4 μL的抗体预混合液，室温孵育过夜。

磷铷测定工作流程。

图2。磷铷测定工作流程。

仪表

使用阅读器认证过程中确定的优化参数进行阅读器控制试剂盒和TNFα测定的htf测量。采用优化设置进行Rb检测的htf测量(见表1)协同Neo2™安装了用于铕/Red受体的TRF激光读取立方体(立方体18和41)。选择的读取模式为顶部位置的后机匣激光器，以利用双pmt光路。双光倍增管(PMT)增益设置使用自动增益功能进行优化。读取高度设置为6.75 mm，使用自动调节板高度校准，使用384孔，小体积板。其余的设置是基于htf阅读器认证测试过程中确定的参数。

Synergy Neo2配备了后机匣激光立方体，具有上述设置，用于快速捕获双发射中机匣测量。

表1。Synergy Neo2配备了后机匣激光立方体，具有上述设置，用于快速捕获双发射中机匣测量。

结果

数据归一化以解释细胞电镀的差异，通过计算信号比实现:受体信号除以供体信号，并将每口井的值乘以10,000，如下式所示:

Delta F (DF%)表示使用内部检测控制来比较每日变化的检测的信号到背景。DF%是用信号与背景比之差除以背景比计算出来的，如下式所示:

HTRF阅读器控制套件

HTRF Reader Control Kit用于验证需要超过Cisbio提供的标准的激光参数(表2)。收集到的数据超过了典型的检测性能标准，只需1次闪光，标准0 CV = 6.5%，低校准器DF = 39%，高校准器DF = 1115%， S/N = 412(表3)。

HTRF阅读器控制套件规范。

表2。HTRF阅读器控制套件规范。

阅读器控制套件的性能数据。

表3。阅读器控制套件的性能数据。Synergy Neo2安装了激光，与htf阅读器控制套件一起使用，用于验证阅读器参数，以满足或超过典型的检测性能规范。


人TNFα测定

人TNFα检测试剂盒用于验证满足或超过LOD检测标准所需的激光参数(见表4)。Synergy™Neo2能够在10次闪光的情况下超过典型的检测标准，比CVs≤2%，LOD = 6.6 pg/mL(表5和图3)。

人TNFα测定标准。

表4。人TNFα测定标准。

人TNFα实验数据。

表5所示。人TNFα实验数据。

人TNFα测定。

图3。人TNFα测定。


Phospho-Rb检测

在高通量384孔的白色固体小体积微板中，每一种药物浓度的细胞分别重复4次，并允许其与孵育过夜。将激酶抑制剂palbociclib的11点半对数序列稀释系列(包括零化合物添加)添加到每个孔中，并在添加裂解试剂前孵育6小时。在室温下孵育1小时后读取htf信号。的集成电路50使用Prism软件(GraphPad software, Inc.， La Jolla, CA, USA)中的四参数剂量响应曲线拟合确定浓度(图4)50价值与以前报告的数据有很好的相关性2．

抑制剂滴定

图4．抑制剂滴定。在384孔微板中，均质HTS单板方案产生的HCT116细胞Palbociclib剂量反应。


用8次+/- palbociclib (10 uM)重复测量计算Z因子。测定结果Z '因子为0.63，表明在高通量微板格式中具有非常稳定的测定性能和低变动性(表6)。

Z' -因子。

表6所示。Z' -因子。

讨论

的协同™Neo2配置后机匣激光器和多达4个pmt允许高通量的分析开发和筛选。帕波ciclib对代表性癌细胞系的剂量反应滴定导致IC50与先前报告的值相关联的值2．Synergy ne2提供快速检测，这是高通量分析格式所必需的。384口井，每口井10次闪光，读取时间约为2m42s。由激光激发提供的改进的灵敏度允许简化工作流程的执行，正如在384孔分析格式中执行单板协议的能力所示。检测和仪器的结合为各种应用的高通量检测提供了理想的解决方案。

参考文献

  1. 芬恩，理查德·S.;溪谷,朱迪;康克林,迪伦;卡劳,Ondrej;大卫·科恩;Desai, Amrita J.t al. (2009): PD 0332991是一种选择性周期蛋白D激酶4/6抑制剂，在体外优先抑制腔内雌激素受体阳性的人乳腺癌细胞系的增殖。《乳腺癌研究》11 (5)，R77。DOI: 10.1186/ bcr2419。
  2. 大卫·弗莱;帕特里夏·j·哈维;保罗·r·凯勒;威廉·l·艾略特;米德,MaryAnne;Trachet, Erin等人(2004):PD 0332991对细胞周期蛋白依赖性激酶4/6的特异性抑制及其在人肿瘤异种移植中的相关抗肿瘤活性。《分子癌症治疗学》3(11)，1427-1437页。
  3. 圣人,j .;穆里根，g.j.;阿塔尔迪，l.d.;米勒,a;陈,美国;Williams, B.等人(2000):靶向破坏三个rb相关基因会导致G(1)控制的丧失和永生。《基因与发育》14(23)，3037-3050页。DOI: 10.1101 / gad.843200。
  4. 许,珍妮;Arand,茱莉亚;Chaikovsky,安德里亚;南希·a·穆尼;得墨忒耳,Janos;Brison, Caileen M.等人(2019):E2F4独立于RB家族调节小鼠胚胎干细胞的转录激活。《自然通讯》10(1)，第2939页。DOI: 10.1038 / s41467 - 019 - 10901 - x。

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