基于高通量发光的活细胞检测实时测量ß-Arrestin招募

相关Gen5样本文件:181228 NanoBiT 1536好

作者: Peter Brescia和Peter Banks, BioTek Instruments, Inc.应用部门，Winooski, VT美国;艾琳·帕奎奥，布洛克·宾科夫斯基，艾米·兰德莱曼，Promega公司麦迪逊，美国威斯康星州

摘要

描述蛋白质:与G蛋白偶联受体信号(GPCR)相关的蛋白质相互作用(PPI)对那些研究潜在可药物靶点的人非常有兴趣，然而，端点测定缺乏关于细胞相互作用随时间变化的有价值的信息。通过结合一种新型的高通量分析工作流程和基于动态发光的随时间的免提测量，可以以一种有效的方式更充分地定义活细胞中的PPI动态。

简介

G蛋白偶联受体(GPCRs)及其在细胞信号传导中的作用仍然是确定可药物靶点的共同努力的焦点。对GPCR信号通路中蛋白:蛋白相互作用(PPIs)的研究，如GPCR:ß-arrestin2相互作用，提供了一种更好地了解炎性疾病、纤维化和癌症相关途径的手段¹．

这些相互作用的动态活细胞测量捕获了重要的实时信息，否则使用端点测量可能会遗漏这些信息。来自Promega公司的NanoLuc®二元技术(NanoBiT®)是一种双组分结构互补报告器，能够在Nano-Glo®活细胞检测系统中实时测量活细胞中的PPI动态，并使用简单的生物发光读数。在实验中，大BiT (LgBiT;18 kDa)和小BiT (SmBiT;11个氨基酸肽)亚基融合到感兴趣的蛋白质上，如图1中蛋白A和蛋白B所示。当被标记的蛋白质相互作用时，NanoBiT亚基聚集在一起形成一个活性酶，产生一个明亮的发光信号，可被基于发光的微板读取器检测到。非裂解分析法允许实时测量蛋白质相互作用动态一到两个小时。

图1所示。NanoBiT检测概述。

在这里，我们使用专门的NanoBit CX3CR1/ARRB2细胞，来源于在HEK293细胞中CX3CR1/ARRB2的稳定表达，并被CX3CL1配体(fractalkine)的添加激活，来演示GPCR: ß-arrestin2招募试验(图2)。该试验在1536孔微板格式中进行，使用自动液体处理程序和多模微板阅读器的发光模式。CX3CL1的剂量反应滴定和Z′-因子测定被用来评估自动化检测的性能。

图2．NanoBit CX3CR1/ARRB2细胞。来自于HEK细胞中CX3CR1/ARRB2稳定表达的NanoBit CX3CR1/ARRB2细胞，允许实时研究GPCR: ß-arrestin2募集。

材料与方法

材料

细胞和试剂

NanoBit CX3CR1/ARRB2细胞(目录号;CS208104A)和纳米glo活细胞检测系统(目录号:CS208104A)。N2012)，由纳米glo活细胞衬底和纳米glo LCS稀释缓冲液组成，由Promega公司(Madison, WI)慷慨捐赠。芽孢杆菌素S HCl(目录编号;A11139-03)、TrypLE™Express Enzyme (1x)、苯酚红和Opti-MEM™还原血清培养基(目录编号11058-021)均购自Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)。重组人fractalkine (CX3CL1，目录编号300-31)从PeproTech, Inc. (Rocky Hill, NJ)获得。

Synergy™Neo2混合多模式阅读器

Synergy Neo2多模式阅读器是为速度和超高性能而设计的，融合了BioTek的专利混合技术™，具有独立的光路，确保性能不受影响。连续可变带宽四倍单色仪，灵敏的高透射滤波器光学和多达四个光电倍增管(pmt)提供了超快的测量和优异的结果。先进的环境控制，包括可用的CO₂/ O₂控制，培养到65°C和可变震动，支持活细胞测定，而细胞基础检测优化与直接底部照明。

MultiFlo™FX多模式分配器

MultiFlo FX是一种自动多模式试剂分配器，适用于6- 1536孔微板。MultiFlo FX在其模块化设计中集成了几种独特的技术，例如并行分配，RAD™(随机存取分发)和正在申请的专利AMX™(自动介质交换)模块，以促进各种液体处理应用，从2D和3D细胞培养到浓度归一化分析，ELISA，珠基分析等。完全配置的MultiFlo FX可替代多达5个液体处理程序，节省空间、时间和仪器预算。MultiFlo FX集成到BioSpa™8自动化孵化器和BioTek成像仪或多模式阅读器，用于许多细胞成像和生化应用的完整工作流自动化。

方法

细胞的准备

按照制造商推荐的标准组织培养方法培养NanoBiT CX3CR1/ARRB2细胞系和HEK293。用浓度为5 μg/mL的芽孢杆菌素维持选择压力。用TrypLE分离试剂温和处理，在80-90%融合时收集细胞。然后通过离心收集细胞，在Opti-MEM培养基中以所需的细胞密度重悬，在37°C、5% CO孵育期间进行血清饥饿₂4-6小时。

纳米比特分析工作流程

Nano-Glo活细胞试剂制备为5倍原液，按照制造商的建议用Nano-Glo LCS稀释缓冲液稀释Nano-Glo活细胞基质，并混合添加到细胞悬液中。使用MultiFlo FX将细胞分散到1536孔的白色固体微板中，体积为5 μL，浓度为60万个细胞/mL，结果为3000个细胞/孔。

在加入激动剂之前，在环境温度下使用Synergy Neo2进行大约10分钟的发光测量，参数如表1所示。

表1。Synergy Neo2 Reader参数。Synergy Neo2配备了一个配有1536孔孔径(3.5 mm)的发光过滤器立方体，在上述设置下，用于快速捕获动力学测量。

已知的CX3CR1激动剂fractalkine在Opti-MEM培养基中以2倍浓度制备为8点1:3串联稀释系列，稀释范围为30-0 nM，使用MultiFlo™FX在相等的5 μL体积中添加8个重复。使用Synergy™Neo2进行发光测量，最小读取时间间隔约为每90秒，持续60分钟。


NanoBiT计算

通过将每个数据点、添加fractalkine后的相对发光单位(RLU)除以在添加fractalkine之前的最终RLU测量，数据归一化以考虑细胞电镀的差异。然后利用压裂后的动力学测量数据计算曲线下的积分。

使用36个重复数据点计算Z′-因子，分别用于阴性和阳性对照井，使用单独的载具，以及剂量响应滴定法中fractalkine的最高浓度，分别为0和30 nM。
结果

Fractalkine滴定

欧共体₅₀使用Prism中拟合的四参数剂量响应曲线确定浓度，如图3所示(GraphPad Software, Inc.， La Jolla, CA)。欧共体₅₀0.75 nM的值与之前发表的数据a2相关性良好(表2)。

图3。受体激动剂滴定。(a)原始的动力学发光数据。(b)基于动力学曲线下添加Fractalkine后面积积分的Fractalkine滴定剂量响应曲线。

表2．电子商务₅₀激动剂fractalkine的值是通过高通量1536孔的分析格式确定的。

Z因子的测定

通过在30 nM浓度下对+/- fractalkine进行36次重复测量计算Z'- factor(图4)。试验结果的Z'- factor为0.81，这表明试验性能非常稳定，变异性低(表3)。

图4。Z因子的决心。(a)原始的动力学发光数据。(b)基于压裂后动力学曲线下面积积分的控制测量。

表3。Z′因子值采用高通量1536孔分析格式确定。

结论

活细胞NanoBiT分析允许在生物相关的环境中以符合高通量筛选工作的格式进行动态受体招募的研究。在HEK293背景下，使用CX3CR1-LgBiT:SmBiTAARB2进行fractalkine的剂量反应，导致EC₅₀0.75 nM，与之前报道的值相关。Synergy™Neo2提供快速检测，这是高通量分析格式所必需的。1536孔的读取时间少于8分钟，同时仍然提供高鲁棒性的分析，Z ' -因子为0.81。检测和仪器的结合为蛋白质的高通量检测提供了理想的解决方案:蛋白质相互作用。

参考文献

1. 彼得森,Y.K.;阻滞素支架在G蛋白偶联受体信号通路中的不同作用。中国生物医学工程学报，2017,29(3):366 - 366。
2. Paguio, a;巴特勒,b;Hartnett, j .;斯莱特,m;稳定表达NanoBiT融合蛋白的新型克隆载体。[在线]2018年11月;Promega网站。https://promega。media/-/media/files/2022卡塔尔世界杯完整赛程resources/ posts /300-500/bibitcell- lines-nanoluc-luciferase-poster.pdf(已于2019年3月8日访问)。