基于多路磁珠的人体细胞因子测定-使用ELx405自动磁珠洗涤

作者: Paul Held博士，BioTek Instruments, Inc.应用部门首席科学家

细胞因子和生长因子是介导许多生理反应的细胞信号蛋白。此外，它们还与一些疾病有关，包括肿瘤生长和转移、感染和炎症。因为这些分子很少单方作用，所以同时评估它们的数量是很重要的。使用Luminex珠技术的多重分析的出现简化了对样品进行多重分析的任务。这里我们描述BioTek的使用ELx405磁珠清洗机可自动清洗Bio-Rad人类细胞因子8-plex检测试剂盒的步骤。

细胞因子和生长因子是小的(8-30 kDa)水溶性蛋白和糖蛋白，参与细胞信号传导。许多不同的细胞细胞因子和生长因子都有一个匹配的细胞表面受体，它通过随后的细胞内信号级联传递信号，改变细胞功能并引发细胞反应。细胞因子和生长因子与炎症、自身免疫性疾病和癌症[1]有关。

几乎所有的细胞因子都是多效因子，具有多种生物活性。此外，多种细胞因子往往具有重叠的活性，单个细胞经常与多个细胞因子相互作用，产生看似相同的反应。不同类型的细胞对相同的生长因子或细胞因子可能有不同的反应，这在一定程度上可以通过这些细胞中表达的基因的不同光谱以及驱动基因表达[1]的各种转录因子的可用性和水平来解释。

细胞因子的特异性受体已被识别并根据功能进行分类。其中包括:(1)以IL-1受体为代表的免疫球蛋白(Ig)超家族存在于全身;(2)造血生长因子家族，如IL-2受体;(3)干扰素类型，包括INF-a和INF-g受体;(4)肿瘤坏死因子(TNF)受体家族，它们共享一个富含半胱氨酸的细胞外结合域;(5)最后是7个跨膜螺旋受体家族，包括g蛋白偶联受体(GPCRs)。除了GPCRs，趋化因子受体CXCR4和CCR5也包括在这个家族中，它们也与HIV结合蛋白相互作用。

细胞因子已被几种不同的方法测定，其中最著名的是ELISA。在ELISA中，抗体从样本中单独捕获和量化特定的细胞因子。这些分析通常在微板(96-，384-和1536-孔)中进行。酶联免疫斑点法(ELISPOT，酶联免疫斑点法)是酶联免疫吸附法(ELISA)的改良方法，用于检测活细胞分泌的细胞因子产物。乐鱼平台入口细胞被沉积在涂有针对相关细胞因子的抗体的膜上。经过足够的潜伏期后，用针对不同表位的第二抗体在分泌细胞周围的环境中检测到感兴趣的蛋白质。该信号由HRP酶/底物产生，产生分泌细胞的彩色足迹，并通过视觉评分进行量化。细胞因子生物测定法，无论是直接的还是使用中和抗体的，都是通过原代细胞或依赖和/或对相关细胞因子有反应的细胞系的某种增殖测定法(如XTT, MTT)来测定生物活性。免疫荧光染色和流式细胞术使用荧光标记抗体在单细胞水平检测细胞内细胞因子和表面受体。这些检测方法，以及其他的检测方法，要么是运行检测所需的时间长度，要么是每个分析物都需要分别定量。 The bead based technology employed by the Bio-Rad multiplex kits allows multiple analytes to be assayed concurrently in as little as 1.5 hours. Here we describe the use of the ELx405 MB Automated Microplate washer to automate the wash steps in the Bio-Rad Bio-Plex Pro human Cytokine 8-Plex Assay.

分析的基础

Bio-Rad Bio-Plex Pro™检测使用由聚苯乙烯微球组成的珠，直径约6.5微米，已浸渍铁氧体颗粒和两种荧光染料的混合物。染料的相对体积经过精心调整，可提供100种不同的颜色，可用于区分珠子，并提供一种同时测量微孔中多达100种分析物的方法。通过将分析物特异性一级抗体偶联到微球表面，并使用荧光标记的报告标签与捕获的分子结合，可以捕获分析物分子。在代谢激素分析的情况下，捕获分子将是针对细胞因子分析物的一种抗体，而报告标记将是针对生物素标记的蛋白质上不同表位的一种二抗体。然后，使用用藻氰菊酯标记的链霉亲和素提供荧光读数，该亲和素直接与二抗的生物素部分结合。结合藻氰菊酯的量与分析物的量成正比。

材料与方法

Bio-Rad Bio-Plex Pro™人体细胞因子磁珠板，目录编号M50-000007A，用于评估ELx405 MB洗衣机的性能。根据试剂盒说明书生成一系列校准曲线并进行测定。简单地说，珠液混合物首先使用ELx405 MB和所提供的化验洗涤缓冲液洗涤两次，以去除珠液中任何残留的储存溶液。将重组的人体细胞因子标准物按1:4顺序稀释，生成8个工作多重标准物。这些标准包含8种不同的分析物。重构后，将标准品和样品各50µL移至检测微板的珠孔中。反应被允许在室温下孵育30分钟(RT)，在摇板上搅拌。孵育后，使用ELx405 MB全自动微洗板机(BioTek仪器)按照下面的洗涤说明进行洗涤。洗涤后，加入25µL的检测或二抗试剂，在RT下搅拌孵育30分钟。再次洗涤三次，然后加入50µL的SAPE试剂。 After 10-minute incubation with agitation to allow for reporter tag binding to occur, the plate was again washed as described in the washing instructions. The samples and standards were then resuspended in 125 µL of assay buffer. Samples were then read on a Luminex 100 reader with XPONENT 3.1 software using the parameters outlined in the assay kit instructions (Figure 2).

图2。细胞因子测定流程

洗涤说明

使用ELx405 MB微洗板机(Bio-Tek Instruments)进行自动洗板。洗衣机的板载键盘编程“Link”功能用于将三个洗涤程序连接在一起，当一起使用时定义一个“阶梯形”吸入(表1)。初始浸泡程序(SOAK60)连接到两个不同的洗涤程序(MAGX2或MAGX3)中的一个，这取决于所需的检测程序，然后是最终吸入程序(final)。浸泡程序允许60秒的珠被磁铁捕获，而清洗程序分配和抽出200 μ L为两个或三个循环。

表1。用于Bio-Rad Bio-Plex Pro™8-plex细胞因子检测的ELx405 MB洗涤协议。对试剂盒提供的Greiner检测板的参数进行了优化。

清洗程序还采用了周期之间的短浸泡程序(30秒)，以便重新捕获液体分配期间重新悬浮的任何珠子。这两种洗涤程序都不需要最终抽吸。最后的抽吸是通过第三个程序完成的，该程序使用的抽吸高度低于清洗程序使用的吸吸高度，留下的残余液体明显更少。每道工序的具体参数如表1所示，并根据珠粒滞留率和洗涤效率进行了优化。

结果

最初的实验集中在珠子的回收上。通过读取步骤获取时间评估恢复。获得每种类型的50颗珠子所需的时间与样品中珠子的数量成反比。在两个独立的实验中，当使用ELx405 MB洗涤样品时，Luminex Reader平均需要7.22秒或6.19秒来解释Bio-Plex Pro™人类细胞因子试验的8种不同珠分析物中的50个珠(表2)。在这两种情况下，每个孔平均统计约500个事件，提供每秒70-80个珠的采集速率(表2)。

图3。两次试验中不同珠粒类型珠粒计数的比较。每个柱状图代表6口井的平均值。

作为数据分析的一部分，还通过观察8-plex试验中不同类型珠的珠数来评估珠回收率。Luminex读取器配置为每种类型至少有50个珠子。如图3所示，来自两个独立实验的不同珠型，每个实验都有27个不同的8-plex实验孔，平均有55个或更多珠。两个单独的运行显示非常相似的珠数，表明洗衣机的性能是一致的。

	实验1	实验2
获取时间(秒)	7.22	6.19
事件总数(珠子)	498.2	500.88
采集速率(珠/秒)	69	81

表2。从不同的测定获得时间和速率的比较。

当检测来自单个井的珠数时，平均计数为495±39个珠(图4)。来自板上不同区域的单个井的珠数几乎相同，这表明在整个96个井板上进行的清洗是均匀的。

图4。特定井位的珠珠总数。数据表示四种不同测定的平均值。

使用已知的分析物浓度，通过绘制中位荧光强度(MFI)信号与浓度的关系，生成每个细胞因子的一系列标准曲线。然后可以对这些标准曲线进行插值，以确定未知样品的浓度。与ELISA反应一样，为了获得有用的结果，有效清洗去除非特异性抗体结合是至关重要的。然而，不同于ELISA反应，固体表面是微板本身，以珠为基础的分析，珠的保留是同样重要的。如图5所示，使用ELx405 MB在96孔微板格式中洗涤磁珠多重分析，结果得到非常可靠的数据。这些标准曲线可用于计算未知样品浓度，置信度高。

图5。Bio-Rad的Bio-Plex™8-plex人体细胞因子面板标准曲线。

实验结果的一致性通过随后几天的实验进行测试。如图6所示，试验的逐日一致性相当好。在两个不同的天进行的IL-4实验的校准曲线的中位数荧光强度(MFI)几乎是相同的。8-plex分析的其他分析物也观察到了类似的结果(数据未显示)。

图6。多次试验IL-4标准曲线的比较。

测定精度是洗涤效率的一个很好的指标。如图7所示，复制样本的cv一般都很低。分布是这样的，超过40%的样本的复制cv低于2.5%，超过75%的样本的复制cv低于5%。这些数据表明，ELx405可以彻底清洗珠粒，并且在井与井之间保持一致。

图7。描述标准曲线中数据点频率的直方图，横坐标表示cv。

讨论

有几个参数需要优化，以实现最佳的结果与自动磁珠洗衣机。正确定位的吸入管是关键的良好珠回收。虽然几乎所有96井板都符合SBS定义的占地面积，但每个板的生产使用的井的几何形状略有不同，需要进行优化。来自BioTek的ELx405 MB有能力在三个不同的运动轴上调整吸入和分配管，这大大简化了这项任务。
正确的洗衣机保养对良好的洗衣机性能很重要。吸入和分配管需要没有任何障碍。阻塞通常是由于未能在会议结束时用去离子水冲洗流体造成的。溶解的盐和/或蛋白质会结晶并覆盖在管的内外表面，导致完全或部分堵塞。这不仅会影响与桥塞直接相关的井，也会影响板上的其他井。堵塞的井将导致压力或流体在未堵塞的管道中流动增加。
磁珠洗涤的一个关键环节是磁珠回收。因为微珠没有物理上附着在微版上，使用不适当的垫圈参数设置会导致严重的微珠损失。在这些实验中，我们采用了阶梯式抽吸高度，以最大限度地提高珠的回收率，同时最大限度地减少洗完后留在井内的残余流体。如果吸入管与珠子的距离太近，就会由于冲刷而造成珠子的严重损失。对除最终吸入外的所有吸入都使用较高的z偏移量，通过最小化除最终吸入外的所有吸入的冲刷效应，可以减少累积珠珠损失。微粒会聚集在微板阱中最靠近捕获磁铁的区域。在这些实验中，磁铁(BioTek P/N 7103016)被设计用来在整个井的底部拉一层薄膜中的珠子。从井的边缘吸取，加上适当的z高度，似乎比中心吸取留更多的珠子。

参考文献

1.曼托瓦尼，A. B.萨维诺，M. Locati, L. Zammataro, P. Allavena和R. Bonecchi。(2010)癌症生物学和治疗中的趋化因子系统。细胞因子与生长因子研究进展，21:27-39。

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