使用Agilent BioTek Cytation C10共聚焦成像阅读器可视化小鼠视网膜血管系统2022世界杯附加赛决赛

介绍

老鼠的视网膜是应用最广泛的一种在活的有机体内研究血管生成及其相关病理的系统。小鼠出生时实际上没有视网膜血管系统，但在出生后的第一周内，视网膜血管从视神经开口向视网膜表面周边放射状扩张(图1A)。在这个扩张前沿是特化的尖端内皮细胞，它们使用肌动蛋白为基础的细胞延伸物，称为丝状足，来感知生长因子梯度(图1B)。这些丝状伪足的宽度可相差几百纳米。一旦最初的血管系统到达视网膜的外围，新生的血管开始分支进入视网膜，最终成熟为三层神经丛(图2A)。

视网膜脉管系统非常适合进行高分辨率成像，因为它位于视网膜前50 ~ 60 μm的表面(图2B)。虽然该脉管系统的可及性相对理想，但丝足的宽度较窄，以及获得足够分辨率以分辨神经丛的多层图像所需的深度对宽视场显微镜构成了重大挑战(图1)。本应用报告描述了一种方法，使用cyation C10共聚焦成像阅读器，结合Gen5微板阅读器和成像软件的图像处理能力，克服这些挑战。生成小鼠视网膜脉管系统的分辨率更高的描述。

图1所示。发育中的小鼠视网膜血管中的丝状足。(A) 4倍成像的完整的新生小鼠视网膜(P4)。绿色:isolectin B4-Alexa Fluor 488，蓝色:Hoechst 33342，红色:Alexa Fluor 546-phalloidin。(B)末端内皮细胞芽状丝状足细胞a1的艺术描绘。(C)和(D)血管扩张前缘有丝状足的尖端内皮细胞(白色箭头)，用40倍镜(0.6 NA)以(C)广角或(D)共聚焦模式(60 μm圆盘)成像。最大强度投影由5 μm z-叠加产生。绿色:isolectin B4-Alexa Fluor 488。

小鼠视网膜成像的样品制备

成年和P4小鼠眼睛是从BrainBits, LLC (Springfield, IL)购买的，并在Hibernate A完整培养基中连夜活体运输。到达后，摘除角膜，眼睛立即用4%多聚甲醛(在PBS中)固定两小时。固定后，在眼罩上做4个从前到后的切口，然后用镊子将视网膜从巩膜上轻轻剥离。因为眼睛是球形的，所以要把它平铺在盖片和载玻片之间，切口是必要的。接下来，视网膜在0.5% Triton X-100中渗透1小时，然后在5% BSA中阻塞。然后用兔抗gfap抗体Cat# RPCA-GFAP(来自EnCor Biotechnology, Inc. (Gainsville, FL))和Alexa氟偶联隔离素B4 (Cat# 121411，来自Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA))在4°C下对被阻塞的视网膜进行免疫染色。在含有0.1% Tween 20的PBS中洗涤三次后，视网膜在Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)的与Alexa Fluor 555 (Cat# A21428)共轭的山羊抗兔二级试剂中孵育。最后，使用Fluoromount- G, Cat# 0100-35，来自Southern Biotech (Birmingham, AL)的Fluoromount- G将视网膜安装在滑梯和#1.5玻璃盖层之间。

图2。发育的小鼠视网膜的血管丛。(A) 4倍成像的完整装片成年小鼠视网膜(3mo)。缝合图像由5x5蒙太奇生成。绿色:Isolectin B4-Alexa Fluor 488，蓝色:Hoechst 33342，红色:Alexa Fluor 546-phalloidin。(B)完全发育的视网膜的艺术横切面，图示三层血管丛，由上、内、深三层血管丛1组成。(C)以40倍(0.6 NA)成像的“分区”最大强度投影，隔离了发育的视网膜脉管系统的三个神经丛，要么是广角(上面板)，要么是共焦(下面板;60μm盘)。从包含整个三层神经丛的z堆中提取。(D)在宽视野或共聚焦模式下，40x (0.6 NA)成像的发育血管丛的正交视图(xz)。 Z-stacks were rendered with the 3D viewer in Gen5 microplate reader and imager software.

成像程序与处理

在手动模式(IMM)下，使用Cytation C10共聚焦成像阅读器和Gen5软件，在40倍下捕获P4(图1)和成年小鼠视网膜(图2和3)的共聚焦和宽视场z叠图像。一旦确定了感兴趣的区域，通过选择“显示饱和像素”按钮，将每个通道的动态范围最大化。对每个通道的曝光设置进行调整，使其处于范围内，没有饱和像素。z范围是通过在样本上下切换来确定的，直到感兴趣的结构(在本例中是血管)在强度上消退。z步长是通过Nyquist抽样建议设置的;对于使用40倍空气物镜(NA = 0.6)成像Alexa Fluor 488，确定宽视场步长为1 μm，共焦为0.6 μm。然后，使用基于物镜的点扩散函数对原始图像进行五次迭代反褶积。然后对反卷积图像进行预处理，以减少背景信号。IB4-AF488 (GFP通道)和αGFAP-AF555 (TRITC通道)的背景缩小滚动球尺寸均设置为50 μm。对于P4视网膜，通过应用包含整个z-堆栈的最大强度投影(Maximum Intensity Projection)来可视化丝状足(图1C和1D)。 For the adult retina, zoned z-projections were generated that isolated each of the three matured retinal plexus (superficial, inner and deep plexus) (Figure 2C). Lastly, to better visualize the tri-plexus layers of the adult vasculature, 3D renders were generated using the 3D viewer in Gen5. Improved z-resolution is demonstrated by rotated the 3D rendered z-stacks to show the orthoganol x-y orientation (Figure 2D and 3B).

图3。星形胶质细胞与上神经丛相互作用。(A)用αGFAP (Alexa Fluor 555继发)以及隔离蛋白B4-Alexa Fluor 488、Hoechst 33342和Alexa Fluor 647-phalloidin免疫染色的整片成年小鼠视网膜(3mo)。在宽视野或共聚焦模式(40 μm圆盘)下，以40倍(0.6NA)捕获z -堆栈，并生成最大强度投影。(B)在宽视野或共聚焦模式下，以40倍(0.6 NA)成像的整个血管丛的正交视图(xz)。星形胶质细胞特异性定位于上丛内。用Gen5微板阅读器和成像仪软件中的3D查看器渲染zstack。

结论

小鼠视网膜是一个完善的体内系统，用于研究血管生成和血管病理。为了评估对血管系统的药理作用或遗传扰动，能够获得尽可能清晰的图像是至关重要的。本应用公告表明，与广角显微镜相比，Cytation C10共聚焦成像阅读器能够提高此类组织的分辨率。

参考文献

1. Sim & Fruttiger。眼科学:让血管远离视线。eLife 2013;2:e00948 DOI: 10.7554/eLife.00948。

仅供研究使用。不能用于诊断程序。

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