微板分光光度法定量dsDNA的研究

简介

DNA被用于从PCR到测序的各种下游应用。分离后DNA定量的标准方法包括260 nm分光光度吸收法和当DNA与结合染料螯合时的荧光法。最常用的方法仍然是分光光度法，由于成本和易于使用。传统的测量已经在一个1厘米径长容器的比色管分光光度计中完成。然而，对于大量核酸样本的分析，微板格式是首选。

方法

紫外吸收

所有双链DNA (dsDNA)标准品都是通过在TE缓冲液(tris-EDTA, pH=7.0)中制备1:2系列稀释浓缩液来创建的。在100 μL的体积中进行三次测量。

荧光

鲱鱼精子DNA，编号D6898，购自Sigma-Aldrich。quantum - it™PicoGreen试剂，型号# P11495购自thermofisher。96孔黑色微孔板(cat # 3915)来自康宁。以TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.5)为稀释剂，将鲱鱼精子DNA稀释至2 μg/mL。最终浓度用260 nm吸光度确定。使用TE和100 μL等分液将纯化的鲱鱼精子从0.0到2000 ng/mL进行一系列稀释。取等量(100 μL) PicoGreen工作定量试剂，室温避光孵育10分钟。工作PicoGreen试剂是根据制造商的建议，将DMSO-PicoGreen浓缩原液1:200用TE稀释。

仪表

紫外吸收

比尔-朗伯定律通过以下公式将吸收和浓度联系起来，其中A = log Io/I = εlc。ε为分析物的消光系数，l为路径长度(cm)， c为分析物的浓度(ng/μL)。

BioTek的读取器控制和数据分析软件，Gen5™，具有内置方法的路径长度校正到1厘米的样品在微板，其中路径长度是由添加的样品的体积定义。计算方法是分别测量977 nm和900 nm处水的吸光度峰值，差值除以0.18，即1cm处水的吸光度，等于样品的路径长度。的协同™LX使用带吸光度单色仪的多模式读取器在单一方案中测量230、260、320、900和977 nm处的吸光度，以实现自动路径长度校正、DNA定量和比率样品纯度评估。

荧光

荧光检测使用Synergy LX Multi-Mode Reader。使用机载软件和触摸屏界面选择适当的过滤器立方体，定义震动参数，添加延迟，选择井位和协议参数。所有测量都使用了一个GFP滤波器立方体(EX 485/20 nm, EM 528/25 nm和510 nm截止二向色镜)。自动增益选择与扩展动态范围。进行30秒的轨道摇动，然后在室温下延迟10分钟孵育。另外，该仪器可以在Gen5软件或导入数据中进行控制和分析。

结果与讨论

使用吸光度和荧光方法定量双链DNA可以分析广泛的浓度范围。紫外吸收法是最常见和最简单的方法，不需要额外的试剂，但可能受到检测的限制，特别是当处理每毫升亚微克的DNA样本时。在这里，我们发现低μg/mL浓度的DNA具有良好的线性关系(图1)。数据表明，在100 μL的体积中，紫外吸收的检测极限为~8 μg/mL或~ 0.8 μg。在不同波长上进行多次紫外吸光度读数的能力也提供了一种验证样品纯度的方法。通常是A的比率₂₆₀/一个₂₈₀用于1.8 - 2.0之间的值，表示纯样品。典型的情况是，对于浓度很低的样品，由于a的影响较大，比值通常低于期望值₂₈₀(表1)。

图1所示。吸光度测量。在TE缓冲液中制备了0 ~ 550 μg/mL的鲱鱼精子DNA稀释系列。标准品在标准96孔微孔板中以100 μL的体积分析，一式三份。一个₂₆₀测量值经过路径长度校正。

表1。一个₂₆₀/一个₂₈₀比率。在260和280 nm处的吸光度测量比值可用于获得样品的纯度。纯DNA的典型比例范围为~1.8 - 2.0。

荧光方法的使用可以将定量范围扩展到标准微孔板分析格式中DNA的picogram数量。在这里，我们展示了测量低ng/mL数量DNA的能力(图2)。数据表明，在100 μL的体积中，荧光检测的极限为~121 pg/mL或~ 12.1 pg。

图2。荧光测定。在TE缓冲液中制备了0 ~ 1000ng /mL的鲱鱼精子DNA稀释系列。在标准的96孔微孔板格式中对标准进行三份分析。

结论

Synergy™LX多模式阅读器提供了生物研究中最常用的检测技术，包括吸收，荧光和发光检测。在这里，我们证明了它的效用，量化DNA在微板使用固有的紫外检测和荧光分析，以扩大可测浓度的动态范围。