2021年1月8日
简介
空斑测定仍然是测定溶原性病毒滴度的标准方法。该方法依赖于确定在病毒感染细胞单层中产生的空斑形成单位(PFU)的数量。当病毒感染的细胞裂解时形成空斑，导致后续的感染周期和邻近细胞的裂解。用反染剂(通常是结晶紫溶液)和光学显微镜或目视检查来鉴定被未感染细胞包围的细胞死区或斑块。根据病毒的不同，斑块可能需要数天才能形成，通常在经验确定的时间后手动计数。在适当的稀释下，每个空斑代表单个病毒粒子的感染和裂解，并与稀释因子一起用于计算每个样品体积的空斑形成单位的数量(PFU/mL)。
上述步骤的实践执行能够实现单个斑块的不同计数。然而，人工计数斑块可能是时间密集和主观的。在这里，我们描述了一个自动成像的斑块分析，使用Agilent BioTek细胞成像多模式阅读器和Agilent BioTek Gen52022世界杯附加赛决赛微孔板阅读器和成像仪软件。该方法提供了一种准确有效的方法来确定斑块计数和计算病毒滴度范围内的微孔板密度，包括6孔、24孔、48孔和96孔格式。
图1．病毒空斑分析工作流程，结合自动成像和分析进行2022世界杯南美区预选赛 而且Gen5软件
空斑分析材料和方法
将BHK细胞悬液添加到6孔微板中，在每孔中形成完全融合且均匀分布的单分子膜。24小时后，取出废培养基，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗细胞。然后将系列1:10稀释的水泡性口炎病毒(VSV)添加到平板上的单个孔中，孵育以吸附。1小时后，取出接种体，用基础培养基洗涤细胞。将琼脂糖半固体覆盖层应用于孔中以防止形成斑块的合并，并将板孵育24小时以允许定量斑块的形成。培养后，细胞单层用4%多聚甲醛(PFE)在室温下固定1小时。固定后，小心去除琼脂糖覆盖层以防止单层破坏。在每个孔中加入结晶紫溶液15分钟，然后用蒸馏水轻轻清洗2-4次。
成像程序与分析
使用BioTek Cytation和Gen5微孔板阅读器和成像仪软件，使用优化的协议确定斑块计数和最终滴度的计算。彩色图像使用彩色亮场和1.25倍物镜捕获。每口井获取一个图像蒙太奇，捕捉整个培养区域，然后将图像拼接在一起，形成一张图像进行分析。基于大小和强度阈值，通过Gen5自动化分析工具使用绿色通道识别单个斑块，并报告总斑块计数、平均斑块面积和每口井的总斑块面积。此外，通过在方案中定义连续稀释，计算并报告每个样本的最终病毒滴度。
图2。自动图像采集和分析为进行病毒空斑分析提供了一种有效和可靠的方法。这个过程概述说明了在系统上执行的三个步骤。Cytation 5捕获了整个井区的彩色亮场图像。然后，Gen5图像分析工具从获取的图像中识别每个斑块，定制的数据导出报告每个样本的详细指标。
结论
病毒空斑试验是一种成熟的测定溶出病毒滴度的方法。然而，传统的分析方法限制了吞吐量并依赖于主观指标。采用Cytation系统和Gen5软件上的自动图像捕获和分析协议，为进行病毒空斑分析提供了方便和可靠的方法。虽然这项研究是在使用彩色亮场成像模式的Cytation 5上进行的，但已经开发了类似的协议，利用其他Cytation模型和Lionheart自动显微镜上可用的倒置相机和彩色亮场成像，以及安捷伦BioTek上可用的直立彩色相机2022世界杯附加赛决赛2022年世界杯抽签
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