细胞分析的发展趋势

作者: Peter Banks，博士，BioTek Instruments, Inc.应用部门，Winooski, VT

使用微板的细胞分析

细胞是生命的最小单位，因此常被用作研究有机体生物学的模型系统。在过去五年左右的时间里，基于细胞的分析的使用出现了两种增长趋势。一是增加化验的生物学相关性，使人体的体内条件更接近;另一个是回归到经典的药理学方法使用表型分析来测量细胞对刺激的功能反应。

为细胞为基础的分析提供更大的生物学相关性的兴趣包括使用

• 内源性表达感兴趣蛋白的细胞系
• 从相关生物体中新鲜分离的原代细胞
• 活细胞分析和动力学读数
• 使用三维细胞培养提供组织样结构的分析

这些进展使得检测的发展更加困难，因为感兴趣的蛋白质的内源性表达水平通常很低，影响了检测的稳健性。原代细胞很难培养，传代几代后就会衰老。活细胞检测需要使用无毒试剂，组织培养条件应保持(37°C/5% CO₂)，以获取较长的动能读数。最后，3d细胞培养需要完全不同的细胞培养技术。

基于靶点的药物发现很大程度上依赖于对疾病干预所选药物靶点的验证。疗效差仍然是药物发现过程中最常见的减员原因之一，这表明药物靶点验证需要更多的努力，在许多疾病状态下，必须解决多个靶点以获得满意的疗效。因此，许多人正努力回归经典药理学方法[1]。在基于靶点的药物发现兴起之前，这些方法都以功能活性为中心:一个经典的例子是使用器官浴，可以测试化合物的生理反应。这些经典的药理学分析方法不需要对药物靶点或作用机制有先入为主的了解，这一方面使得相对于基于靶点的方法，开发分析方法更加困难;然而，另一方面，复杂的疾病生物学与多种蛋白质的协同作用可以通过使用这些功能读数进行分析。今天进行的表型分析使用了同样的概念来监测表型，但通常选择的容器是微板，用于细胞的显示，要么是粘附在微板上的单分子层，要么是三维结构。

用于细胞分析的微板读取器

随着与基于细胞的分析相关的细胞模型变得越来越复杂，microplate阅读器需要适应这些进步。这包括增加高灵敏度的检测模式，如时间分辨荧光，以更好地开发对感兴趣的蛋白的内源性表达的稳健分析，无论是在细胞系还是原代细胞中。Microplate阅读器现在可以在检测室中使用环境控制，这样组织培养条件可以保持(37°C/5% CO₂)，以获取较长的动能读数。微板阅读器可用于三维细胞培养，如那些使用支架，如水凝胶或细胞外基质，但如果使用球形，由于其相对尺寸与微板孔比较小，会有灵敏度问题。由于基于ppmt的微板读取器的光学设计旨在从微板阱中捕获尽可能多的光，涉及活细胞球体的分析主要捕获背景而不是信号。微孔板的成像可以避免这些问题，因为通过使用不同的显微镜目标来定位球体，视野可以很容易地改变，从而提高信本比。这一点已经在许多微板阅读器上得到了证实，这些阅读器实际上是自动数字荧光显微镜，可以成像微板孔中的细胞[2-4]。

微板阅读器是一种以靶为基础的细胞分析的主力。商业试剂供应商提供无数试剂盒和试剂，用于量化[5]中的蛋白表达和细胞[6]、受体结合[7]和细胞信号[8]的分泌。最常见的检测格式之一是使用各种标签的免疫检测。微板读取器也可用于表型分析，如测量活性氧[9]的产生，但使用自动数字荧光显微镜对微板孔中的细胞成像仍然是表型分析中非常流行的检测方法，因为细胞可以用广泛的荧光探针处理，以实现对多种细胞表型[10]的分析。

测量细胞表型也可以提供更准确的结果相对于典型的替代标记的微生物板阅读器。这在抗增殖药物的研究中很明显，基于图像的测定细胞计数和确定细胞周期阶段分布的方法被证明比两种基于代谢的细胞活力/增殖测定格式更准确。研究发现，根据复合作用机制，基于代谢的替代检测往往容易严重低估复合效价和疗效[11]。

自动荧光显微镜与微板阅读器的结合

毋庸置疑的是，在微板中进行的基于细胞的分析在过去十年中不断发展，毫无疑问，它们将继续这样做。从前面的讨论来看，结合传统的ppm基光学显微镜(典型的microplate阅读器)和自动荧光显微镜(典型的HCS阅读器)具有很高的实用性。这将允许在单一实验室仪器中进行最广泛的细胞基础分析应用。微板阅读器的ppm基光学提供了高灵敏度的分析，反映了孔中细胞群的累积信号;而基于ccd的成像则允许对井中细胞进行亚群分析，并使用一种或多种荧光探针对表型进行可视化和定量评估。

现在Cytation™3细胞成像多模式阅读器实现了这一点。Cytation 3结合了自动数字显微镜和传统的微板检测。它已被设计为提供适合的性能为所有最新类型和趋势的细胞为基础的分析，包括

• 在细胞系或原代细胞中使用内源性靶标和底物的表达进行分析
• 活细胞动力学测试要持续好几天
• 在3D格式进行的实验包括支架和球形技术
• 基于图像的表型分析

下面的图1说明了三个独立的光路，它们由Cytation 3作为模块提供。仪器的上部装有传统的ppm基微板读取器光学元件，尽管单色和基于光谱滤波的光路可以在同一仪器中选择。仪器的下部包含基于ccd的显微镜，使用亮场或荧光。

图1．细胞分化3细胞成像多模式阅读器的原理图，说明了三个独立的光路。A: Cytation 3中三个独立光路的配置;B:基于ppm的单色仪波长色散检测;C:基于ppmt的检测，使用光谱滤波器立方体进行波长隔离;D:基于ccd的显微镜，使用led、光谱过滤立方体和2倍至60倍的显微镜物镜。

使用Cytation™3细胞成像多模式阅读器的应用

本文将介绍Cytation 3中基于PMT和ccd的光学技术的一些应用。如前所述，许多这些应用程序利用了基于细胞的分析的最新趋势和类型。

用目标蛋白的内源表达进行活细胞分析

文献报道IL-6分泌被认为是晚期卵巢癌[12]和预后不良的生物标志物。在之前发表的一篇应用记录中，我们使用htf夹心免疫分析法来量化内皮性卵巢癌细胞系SKOV-3[13]中egfined的IL-6分泌。然后，该试验被用于研究一系列小分子抗体和单克隆抗体对IL-6分泌的抑制作用，这些抗体在EGF受体(EGFR)水平和激活途径的各个点上都有抑制作用。采用双板方案，将细胞上清液转移到384孔浅孔板，使用HTRF和高灵敏度ppm基光谱过滤立方光学进行IL-6定量。这种转移有助于使化验方法小型化，节省昂贵的试剂;但也允许使用基于ccd的荧光显微镜对原始检测板中的剩余细胞进行表型活/死试验。该检测由一个蓝色发射细胞膜透性探针组成，它与核DNA结合，并作为活细胞指示器;以及一个红色发射细胞膜非植入探针，它只在细胞膜受损(如坏死或凋亡)时与核DNA结合。下面的图2演示了这个工作流。

图2。在96孔微板上镀SKOV-3细胞诱导/抑制IL-6的分泌。在适当的孵育时间后，将16 mL上清转移到384孔浅孔微板上，使用高灵敏度的基于pmt的光谱过滤立方光学定量IL-6。此外，使用LIVE/DEAD荧光探针和基于ccd的荧光显微镜检测96孔微板中剩余的SKOV-3细胞的细胞活力。

使用的一种小分子抑制剂在全剂量反应中表现出明显高于测试的其他抑制剂的效力。对IC50和高剂量浓度的孔进行成像，并对视野中的细胞进行亚种群分析，以便计算质膜被破坏并被认为死亡的细胞的百分比。下图3显示，EGFR抑制剂AG1478在高剂量下对SKOV- 3细胞具有毒性，这是其明显的抑制效力的原因之一。

图3。使用ppm基光学技术获得EGFR抑制剂AG 1478的全剂量响应曲线;使用基于ccd的荧光显微镜对IC50和高剂量的细胞图像进行叠加。使用一个4倍显微镜物镜获得的视野，图像约1000个细胞在微孔板。在IC50浓度下，只有约5%的细胞表现出活力的丧失;但在~ 10M时，几乎95%的细胞显示细胞膜完整性的丧失。

表型分析

探索与疾病或疾病干预相关的细胞表型是对经典药理学实践的回归。我们最近开发了一种测定方法，用于监测永生化角化细胞中的氧化应激和缺氧，其中细胞表型是由CoCl2[14]化学诱导的。监测氧化应激的荧光探针是一种荧光素衍生物，其产生的绿色荧光强度与活性氧(ROS)的产生成正比;红色荧光探针监测硝基还原酶活性，并用于测量缺氧。传统的ppm基微板读取器可用于评估这些表型，但这些荧光探针固有的背景可能很高。

基于ccd的自动数字荧光显微镜允许细胞亚群分析，通过核染色(即DAPI, Hoechst染料)识别视野内的细胞，从而评估局限于细胞本身的荧光。这有助于显著提高表型分析的信号与背景比(S/B)。这可以通过与化学诱导的角质形成细胞中ROS产生相关的氧化应激表型来说明。使用Cytation 3提供的Gen5 Image+软件，通过DAPI染色创建的蒙版，可以确定视野内所有细胞与氧化应激表型相关的平均绿色荧光。该方法在视场中测量每个细胞细胞核周围的ROS生成，不包括大块溶液背景荧光。通过对绿色通道进行Gen5图像+分析参数调整，扩展掩膜的面积，可以改进该方法，以便评估与ROS产生相关的绿色荧光的细胞质部分。

每一种基于ccd的图像分析方法都减少了背景，相对于基于ppm的光学系统，提供了显著更高的S/B(图4)。

图4。A:用基于ppm的光学和光谱滤波器(紫色圆圈)测量与氧化应激表型相关的活性氧产生的定量分析性能的比较;基于ccd的显微镜与基于dapi的核掩膜(蓝色方格);基于ccd的显微镜与扩展核掩膜，捕捉部分胞质ROS的产生(红色三角形);B:角化细胞的放大20倍图像，其细胞核为dpi染色，核染色相关的掩膜用于量化绿色通道中ROS的产生(阈值:10,000，图像平滑强度:0);C:角化细胞的放大20倍图像，dapi染色细胞核和用于量化ROS产生的扩展掩膜(阈值:500，图像平滑强度:1)。在每张图像中，黄色边框定义了与ROS产生相关的绿色信号被量化的区域。

使用基于球体的三维细胞培养进行活细胞表型分析

如果三维细胞培养方法(如球体)被用于活细胞检测，PMT和基于ccd的光学器件之间的相对检测性能的提高会更加显著。球状体是由大约104到105个细胞组成的细胞聚合体，可以在特殊微板的悬浮培养基滴中生长，也可以在具有超低吸光度涂层的微板中生长。椭球体的直径一般小于0.5毫米。与典型的96井板尺寸相比，直径200 μm的球体覆盖井底的相对面积为~ 0.1%。微板读取器中基于ppml的光学器件旨在最大限度地捕获井中本体溶液发射的信号强度。当信号从椭球体发射时，这些光学器件的缺点是大多采集背景信号。

相反，显微镜的优点是可以通过显微镜物镜的选择来控制视野。Cytation 3的ccd光学系统和4倍显微镜物镜将视野限制在微孔板井底的十分之一。因此，球体占据了这个视野的1%。这在使用10倍物镜后得到了改善，视场缩小到与200 μm ID球体相同的尺度，现在它包含了10%的视场。通过使用Gen5™Image+ s/w创建与球体相同面积的荧光掩膜，背景抑制可以进一步提高。

用红色荧光探针测量硝酸还原酶活性和由约2000个细胞组成的200 μm ID球体进行的缺氧表型试验证明了这一点。图5显示了使用10倍物镜在缺氧时间过程中四个时间点的图像，说明了缺氧信号的增长。

图5．用10倍显微镜物镜成像的肝脏显微组织球形缺氧状态产生的时间过程研究。在球形图像周围看到的黄色边框是由Gen5™软件创建的遮罩。信号采集可以限制在掩模内的CCD像素内，以优化S/B。

图6展示了使用ppm基单色光学和数字荧光显微镜检测cyation™3的相对检测性能，使用4倍、10倍和10倍显微镜物镜，球体周围有红色荧光罩。很明显，采用拒绝大多数背景的方法，即10倍显微镜物镜和红色荧光罩，检测性能最好。

图6。使用PMT和基于ccd的光学对活细胞球基缺氧测定的性能。

利用基于球体的三维细胞培养开发球形形成的分析方法

自动数字显微镜在实验室方法开发中也很有用。例如，利用Perfecta3D®悬滴板技术，Cytation 3已被用于监测球形形成中的细胞聚集。这些平板允许研究人员通过调整细胞密度来创建他们自己的不同大小的球体。标准方案要求在Perfecta3D®板的孔中添加40 L细胞和培养基，用于每个所需的球体。这个体积足以让培养基和细胞在板下悬浮形成。由于没有塑料制品供细胞附着，随着时间的推移，细胞聚集形成球状体。球体的形成高度依赖于所使用的细胞/细胞系。共培养也经常被使用，因此通常需要开发方法来优化球形的形成，使用不同数量的细胞，添加剂和其他条件。悬挂式降板组件包含一系列储液器，以保持位于盖子和托盘之间的板内的湿度水平。这确保了在球形形成过程中很少或没有发生介质蒸发。

Cytation™3可用于监测球体形成[15]。Cytation 3使用低倍率，长工作距离的显微镜物镜，如蔡司2.5倍通过托盘成像球形形成(图7)。

图7。在Perfecta3D®悬滴板中成像悬浮介质滴和细胞中的球形形成。

使用可维持CO的气体控制器可连续数天监测球面层形成情况₂检测室内的培养条件。图8显示了在明亮视野显微镜下，乳腺癌细胞系MCF-7在4天内聚集了5000个细胞。

图8。在蔡司2.5倍显微镜物镜下，MCF-7细胞在Perfecta3D®平板上悬浮滴状聚集成球形。

高内容分析中的“命中选择”

表型分析通常涉及到微板中细胞的自动数字荧光显微镜，因为能够捕获细胞成分的多参数数据和空间信息，这被称为“高含量分析”或HCA。这些HCA仪器被设计成使用许多荧光通道尽可能快地成像微板的每个孔。它们往往非常昂贵，并保留给工业终端用户或有足够资金预算的核心实验室。

将基于ppm的光学和基于ccd的显微镜结合在一个仪器上的一个关键优势是表型分析的“命中选择”。对于涉及荧光强度变化的检测，基于ppmis的光学器件可以用于快速扫描整个平板，只有在荧光强度变化超过阈值水平(本质上是“命中”)时才返回井中进行成像。这已在一项识别细胞缺氧[14]潜在抑制剂的实验中得到证实。永生角质形成细胞在氯化钴(CoCl2)的存在下培养，CoCl2是一种已知的缺氧样反应诱导剂，同时培养的还有由几种已知抗氧化剂组成的氧化还原化合物库。使用一种红色荧光探针，根据硝酸还原酶活性测定缺氧情况。在读取检测的微板之前，创建一个Cytation 3命中选择协议。该方案使用基于单色仪的低氧染料信号读取结果，对RFU值大于或等于50%的低氧条件抑制的井启动成像。

图9。使用“Hit Pick”协议标准选择用于成像的井。

根据图9，使用该方案共成像27口井，包括15口“命中选择”井和12口h排对照井。从这些井中捕获3张图像(3个独立的荧光通道)的时间为3分22秒。与从96口井采集3张图像所需的总时间(12分钟)相比，这意味着节省了3.5倍的时间，以及所需的存储空间。如果考虑到HCA筛选的典型命中率在1-5%左右，那么使用基于ppm的“命中选择”可以提高筛选活动的速度，接近一个数量级，而只需要大约1-5%的数据存储空间。

结论

Cytation 3实现了许多基于细胞的分析的最新趋势，正如本文所描述的应用所证明的那样。这些包括越来越大的生理相关性的分析，使充分的分析性能具有挑战性的条件。有三种可用的光路，包括基于ppmt的检测和基于ccd的成像，为选择所需的检测最合适的读出提供了很大的灵活性。此外，两种检测形式可以一起使用，以减少表型筛选时间和数据存储需求。最后，显微镜模块可以用于常规的实验室实践，如细胞计数和转染效率的测定;并开发了监测悬落板中球形形成的方法。

参考文献

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仪器使用说明

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