2012年10月08
高性能多检测能力，跨越小分子药物发现过程中使用生命技术测定
精确和敏感的工具，以加强药物发现过程是开发有效和安全的小分子疗法不可或缺的一部分。构建评估这些小分子的分析方法涉及标记技术，根据感兴趣的分子需要许多不同的检测方法。为了将昂贵的试剂消耗降到最低的高灵敏度和精确分析，需要专用的荧光光通道、荧光偏振(FP)、荧光共振能量转移(FRET)和时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)。
使用Life Technologies的药物发现分析组合，展示了一种新的多模式微板检测技术的高性能能力。在其他应用中，BioTek协同™NEO旨在提高检测的灵活性、速度和性能，适应于临床前药物发现的各种元素，包括靶点识别和验证、一级和二级筛选、选择性分析和先导优化。Synergy™NEO的专利混合技术™将基于过滤器和单色仪的系统结合在一个紧凑的单元中。可选的集成叠板机具有6秒的板交换时间，提高了效率和步行自动化。除了精确，灵敏度和近地天体探测选项的读取速度，易于设置和使用是这款microplate阅读器的一个特点。
Synergy™NEO专利混合技术™光学系统
GeneBLAzer®beta -内酰胺酶报告技术- FRET(下)
测定原理
GeneBLAzer®β -内酰胺酶报告技术提供了一种高度准确，灵敏，易于使用的方法来监测细胞对候选药物或其他刺激的反应。GeneBLAzer®技术的核心是荧光共振能量转移(FRET)衬底，该衬底产生的比率报告响应以最小的实验噪声。除了受刺激细胞和未受刺激细胞的双色(蓝/绿)读出外，这种比率法减少了可能掩盖潜在生物反应的绝对和相对误差。这些误差包括细胞数量、转染效率、底物浓度、激发路径长度、荧光检测器和体积变化的变化。GeneBLAzer®β -内酰胺酶报告技术已在一系列目标类的高通量筛选(HTS)活动中得到证实，包括g蛋白偶联受体(GPCRs)、核受体和激酶信号通路［1］．
Synergy™NEO检测原理与参数
方法总结
GeneBLAzer®雌激素受体(ER) α和β检测方案使用分裂阻滞(DA)细胞在激动剂模式下进行。简单地说，ER α和ER β DA细胞在2x104细胞/孔的黑色透明底部384孔标准体积(100 μL)微板(康宁P/N 3712)中被镀上2次，对两种不同的17ß-雌二醇激动剂作为16点3倍连续稀释，从1 μM (ER- α)和10 nM (ER-ß)激动剂开始，在8个重复中进行2次测试。每个平板包括16个无细胞对照(CFC)进行空白校正，32个非刺激(8 μL含0.5% DMSO的实验培养基)和刺激(5x17ß-雌二醇)对照进行Z′和响应率验证。NEO由Gen5™v 2.01.14软件控制，如前所示。孵育2小时和4小时后读取培养皿。
结果
LanthaScreen®基于铽和铕的分析- TR-FRET
测定原理
时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)分析方法比其他分析方法更不容易受到化合物干扰，可以应用于多个靶标类别，使其成为药物发现实验室首选的荧光分析方法。LanthaScreen®检测平台提供两套FRET供体/受体对:铽/荧光素和铕/AlexaFluor®647。当供体和受体标记的分子靠近时，会发生能量转移，导致受体荧光增强，供体荧光减弱。TR-FRET分析中使用的给体物种的荧光寿命比背景荧光或散射光长许多个数量级，因此可以在干扰信号完全衰减(时间解析)后测量能量转移。这一特性减少了分析干扰，从而提高了数据质量。TR-FRET的值由特定于frey的受体信号与供体信号的比值决定［1］．
Synergy™NEO检测原理与参数
方法总结
通过对Tb或Eu受体(分别为fll -poly- gt或kinase Tracer 236)进行5次稀释，在10次重复中对2 nM Tb-anti- gst或Eu-anti- gst供体分别分配到黑白384孔小体积微板(例如康宁# 3673，#3676)进行优化的读取参数设置。分析了几种增益配置下的两个测量/孔选项(10和100)，以找到响应比(RR，归一化TR-FRET分析窗口)、Z′和CV%计算得出的最佳分析性能结果与读取器设置一致。Gen5™v 2.01.14软件的最佳检测设置和数据缩减参数如上所示。
结果
Omnia®激酶测定-荧光(动力学)
测定原理
确定激酶活性和调节这种活性的化合物的作用的能力对于开发和筛选抗这些酶的潜在药物是必不可少的。Omnia®激酶分析使用螯合增强荧光团(CHEF)称为Sox，这是一种非自然氨基酸，被纳入到激酶特异性肽底物。在肽被相关激酶磷酸化后，Mg2+被螯合，在Sox部分和磷酸基之间形成桥梁，磷酸基由激酶添加到肽上特定的酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基上。荧光强度与肽磷酸化量成正比［1］．
Synergy™NEO检测原理与参数
方法总结
使用活性Tyr JAK2激酶JH1/JH2和JH1/JH2 V617F在两种浓度(50 ng/孔和12.5 ng/孔)加入和不添加1 μM的强效激酶特异性抑制剂staurosporine (1 μM stausporine)，按照试剂盒说明书进行3个重复的激酶抑制实验。检测在384孔康宁白色微板(#3574)中以20 μL/孔的体积运行。动力学数据以最快的间隔(30秒)收集板块图在一个小时内。
结果
预测器hERG -荧光偏振
测定原理
该Predictor™hERG荧光极化分析试剂盒提供了一组经过验证的成分，可在无辐射配体的情况下进行hERG通道生化结合研究。该方法设计用于通过产生与膜片钳电生理学研究准确相关的数据来识别潜在的hERG通道阻滞剂。该测定基于荧光偏振原理，其中红移荧光示踪剂在结合到hERG通道时显示高偏振，而在被结合到通道的化合物取代时显示低偏振［1］．
Synergy™NEO检测原理与参数
方法总结
在插入试剂盒后，运行两个数据板，每个板上有2组化合物。化合物以起始浓度1x104 nM的16点3倍连续稀释法滴定，每4次重复一次。结合(NC)和移位(PC)对照在两个平板上重复16次。空白井进行了选择性数据校正，但未用于最终结果分析。从孵育2小时开始，到孵育5小时，每小时读取一个培养皿。生成了6个单独的测量/井设置(10、25、50、100、150和200)的数据，以关联检测灵敏度和读取速度。仪器验证的药理学终点包括Z′、分析窗口、精密度和IC50数据。
结果
Z ' - LYTE®激酶测定法- FRET
测定原理
蛋白质激酶和磷酸酶通过蛋白质磷酸化和去磷酸化调节许多关键的生物机制，包括细胞生长、增殖、分化和代谢。参与信号转导的激酶和磷酸酶的活性异常与许多人类疾病有关。人类基因组编码的数百种激酶和磷酸酶的发现，刺激了针对这些酶的潜在药物的快速筛选技术的发展。为了满足这一需求，Z’-LYTE®技术基于香豆素:荧光蛋白FRET供体:受体对之间的荧光共振能量转移(FRET)而开发。这种稳健的、均匀的生化分析方法采用基于荧光的偶联酶形式，并基于磷酸化肽和非磷酸化肽对蛋白水解裂解的不同敏感性。采用了一种比率法，计算了在400 nm处光子激发供体荧光团后，供体发射与受体发射的比率，用于定量反应进程。如果fret -肽被磷酸化(即没有激酶抑制)，则发射比保持较低，如果fret -肽不被磷酸化(即激酶抑制)，则发射比较高。为了解释排放比和磷酸化之间的非线性关系，最终数据应用了一个百分比磷酸化方程［1］．
Synergy™NEO检测原理与参数
方法总结
使用Tyr 1和Tyr 6肽协议进行了两个并行激酶抑制试验，以比较NEO过滤器和单色检测模式。第一种方法是改良的激酶抑制剂Tyr 6肽程序，使用1μM staurosporine(抑制剂)连续稀释16点3倍，对两种JAK2激酶(JH1/JH2 (2600/520 ng/mL)和JH1/JH2 V617F (10000 /2500 ng/mL)在50 μM ATP浓度下的2个浓度进行4个重复。第二个是Tyrphostin AG1478对K运行时的激酶ERBB4 (Her4)的10点½log剂量反应选择性的Tyr 1肽图谱筛选米应用μM ATP。100%和0%磷酸化对照进行Z′、分析窗口(响应率)和磷酸化百分比计算。在剖面分析中加入0%抑制对照，以验证筛选的动态范围。
结果
结论
在本指南中，我们已经演示了协同™NEO的一系列生命技术检测技术的能力。比率检测，包括FRET (Z-LYTE®)，TR-FRET (LanthaScreen®)和荧光偏振(Predictor™)都得益于同时测量供体和受体荧光或平行和垂直偏振测量，从而获得与高通量筛选相适应的微板读取速度。此外，光路的设计使用了最少数量的光学表面，例如没有光纤或额外的反射镜来重定向光，这确保了高光传输到双pmt，从而实现高灵敏度检测。荧光单色仪还提供了很高的灵活性和灵敏度，无论是顶部或底部的阅读能力在各种微板格式，与那些384孔标准和低体积微板强调在这里。后者的能力特别适合于GeneBLAzer®应用程序所描述的基于细胞的分析。本指南中没有说明的其他光路包括基于滤光片的底部读取能力，用于细胞分析，在荧光或发光模式下具有类似的高灵敏度。
参考文献
［1］http://www.lifetechnologies.com/drugdiscovery.html
GeneBLAzer®、LanthaScreen®、OMNIA®、Predictor™hERG和Z’-LYTE®是Life Technologies的商标或注册商标。