基于多体积的蛋白质定量方法

为什么要量化蛋白质?

蛋白质是我们理解生物学的核心。在细胞中，它们有多种用途:从提供结构支持的肌动蛋白到充当调节信号转导途径的酶的蛋白质，如激酶、蛋白酶和磷酸酶;到允许细胞外相互作用的跨膜蛋白，如GPCRs和离子通道。尽管几乎所有的蛋白质都是由同一组20个氨基酸组成的，但它们的结构和功能却有着令人难以置信的多样性，包括通过组成它们的氨基酸可能发生的各种相互作用、它们形成四元结构的能力以及可以调节其活性的翻译后修饰。许多探测蛋白质结构和功能的研究依赖于上游量化，以确保适当的结果。这些下游研究包括质谱分析，以阐明初级结构和翻译后修饰，圆二色和x射线晶体学，以探测二级、三级和四级结构，二维凝胶电泳和western blots，以监测相对蛋白表达和蛋白质阵列，用于高度多重蛋白表达研究。

荧光和吸收光谱都是常用的蛋白质定量方法，但当使用稀释的蛋白质样品(即通常<100 μg/mL)时，前者是首选方法。一般来说，由于吸收分光光度计的广泛使用，吸收定量方法提供了足够的分析性能，并方便许多研究和实验室。当这些方法在微板中执行时，通过增加样品吞吐量实现了便利性;通过使用少量微体积格式的样品简化工作流程。在本应用指南中，详细讨论了适用于微板和微体积分析的基于吸收的蛋白质定量方法。

比尔-朗伯定律

定量可以通过蛋白质中的发色团吸收UV-Vis光或使用比色试剂来实现。比尔-朗伯定律将分子吸收光的物理性质与样品内的浓度联系起来，公式如下:

其中A为Absorbance, Io为通过样品前的激发光强度，I为通过样品后的激发光强度，ε为分析物的摩尔吸收系数或消光系数，l为路径长度(cm)， c为分析物的浓度。分光光度计提供了测量Io和i的方法。用于在分光光度计内保存样品的容器通常具有固定的路径长度，因此，如果蛋白质的消光系数已知，可以简单地使用上述等式确定浓度。如果不知道消光系数(即使用比色试剂)，则可以生成校准曲线，以便对浓度进行插值。

仪器仪表及容器

分光光度法测定蛋白质基本上有三种基本类型的仪器。有专用的吸收分光光度计，使用试管保存单个样品，微板分光光度计(微板阅读器)，使用微板快速处理许多样品，以及专用的微体积分析设备。这些设备，如ThermoScientific公司的NanoDrop系列，在只需要少量蛋白质进行定量的情况下特别有用。此外，它们不需要容器进行分析，因为样品直接移液到仪器的基座上。最近，BioTek Instruments提供了一种微板附件，与微板阅读器一起使用，可以进行类似于这些专用设备的微体积分析。微孔板阅读器和附件的好处是，许多应用也可以用微孔板阅读器进行(如ELISA)。表1概述了这些仪器使用的容器类型的特点，特别是它们可以处理的样品数量、用于分析的路径长度和所需的样品体积。

表1。通常用于蛋白质定量的血管类型的特征。

BioTek Instruments提供一系列的微板读取器，不仅可以测量适合蛋白质定量的吸光度，还可以测量包括荧光、时间分辨荧光、荧光偏振和发光在内的许多其他检测模式。每一个这些微板阅读器都能够在广泛的容器中进行多体积蛋白质定量，包括标准试管(图1)，BioTek的专利BioCell™试管(具有固定的1厘米路径长度)，96孔和384孔微板和使用Take3™或Take3™Trio附件的微体积分析。

图1所示。BioTek微板阅读器的多卷功能。

以比色皿为基础的方法是传统的，通常涉及样品稀释。虽然仪器通常价格低廉，操作简单，能提供精确的测量，但它们的吞吐量有限，每次只能测量一个样本。在一些BioTek microplate读取器中，专用的试管端口是可选的功能，或者，BioCell或试管可以与Take3™附件一起使用。

微板是一次性的，通常由塑料制成，包括低蛋白结合版本。波长特定的光从微板分光光度计垂直移动(图1)通过微板孔和样品。由于样品体积可以在微微板格式中变化，必须应用路径长度校正因子来将结果标准化为1厘米路径长度。BioTek的Gen5™数据分析软件可以通过测量水在977 nm和900 nm处的吸光度峰值，自动计算样品路径长度。然后将差值除以0.18，这是1厘米处水的吸光度，等于样品的路径长度。Gen5的步骤如下:

BioTek的自动路径长度校正和量化(以蛋白质为例):
1.一个₉₇₇——一个₉₀₀样品OD / 0.18 OD =样品路径长度(cm)
2.一个₂₈₀样本- A₂₈₀空白/样品路径长度= OD校正为1厘米
3.校正为1cm的OD *消光系数=井中蛋白质浓度(μg/mL)

基于微板的蛋白质定量提供了更高的样品吞吐量和读取更高浓度的样品的能力，这是由于相对于1厘米试管测量的更短的路径长度的读取能力。此外，坯料、校准曲线和样品可以在同一平板上制备和读取，几乎同时，最大限度地减少培养时间和温度变化，从而提高精度。

BioTek的Take3微体积板(图2)在定制玻片上有16个微斑点，适用于微体积分析。当样品加载时，该板形成一个固定的0.5 mm垂直光程，避免了对高浓度样品的稀释。在BioTek微板读取器中读取样本后，它们可能会被恢复，或将载玻片擦拭干净，因为表面通常会抵抗绑定。还应注意使用标准试管或生物细胞进行1厘米路径长度测定的能力。

图2。取3个微板附件，说明16个微点，2个生物细胞和一个带帽的标准试管。

蛋白质定量方法

蛋白质中含有的氨基酸残基提供了用吸收分光光度法定量的方法。有些氨基酸残基含有天然发色团，如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸中含有的苯环;另一些则提供了可以用比色试剂靶向的官能团。这些氨基酸的数量在蛋白质之间差异很大，因此，蛋白质之间的摩尔吸收率可能相差很大。此外，样品制剂可能含有具有类似吸收光谱的干扰剂，如DNA，或可影响比色试剂衍生化的洗涤剂和缓冲剂。每种方法都可能导致样品测量不准确。因此，应根据所需的通量、可用的样品数量、所需的准确性和对潜在污染物的存在的考虑来选择测定格式。表2包含了目前最常用的基于吸收的蛋白质定量分析方法。

表2．常用的蛋白质定量方法及典型定量范围。

天然蛋白质吸收

最快速、最简单的量化蛋白质的方法是通过在280 nm (A280)处的紫外线(UV)吸光度测量，根据比尔-朗伯定律，蛋白质吸收的光与蛋白质浓度直接相关。由于芳香氨基酸色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的存在，大多数蛋白质在这个波长有一个峰值吸光度。A280测量仍然很受欢迎，因为它们快速，不需要额外的试剂，是非破坏性的，并提供良好的线性动态范围。在某些情况下，如果样品中含有高度纯化的蛋白质(即通过圆二色或x射线晶体学进行结构分析)，并且已知其摩尔吸光度，则可以确定浓度，而不需要校准曲线。

图3展示了BioTek微板阅读器的多卷功能。在图中，比较了传统的1 cm路径长度容器，如BioCell与Take3微板附件的微容积能力(0.05 cm)。这是用两种不同的仪器完成的:一个是吸光度微板阅读器(Epoch™)，另一个是多模式微板阅读器，它能够检测多种检测模式，如荧光、发光等(Synergy™4)。直线不适合数据点，但表示通过原点的斜率为1。因此，落在直线上的数据点证明了测量的等价性。多卷和BioTek仪器的性能相当。

图3。1 cm路径长度测定(BioCell)和使用原生蛋白质吸收率A280的微量体积分析(Take3)之间的比较。左上图显示了在低BSA浓度下大图的扩展部分。

在探索蛋白质表达谱的应用中，样品由许多不同的蛋白质组成，它们都以不同的数量表达，每个蛋白质都有不同的含苯环氨基酸的丰度。因此，摩尔吸光度不能被知道。通常使用模型蛋白(如牛血清白蛋白(BSA))的校准曲线用于从OD测量中插值样品蛋白混合物浓度。当然，这种方法会有一些不准确性，其程度取决于每个蛋白质的相对表达量及其与牛血清蛋白相比含苯环氨基酸的相对丰度。在蛋白质分离过程中，也可能有洗脱缓冲液和其他样品成分干扰定量。这些样品干扰物包括核酸、脂类和碳水化合物，它们可以在280纳米处吸收，因此影响了结果。因此，除非样品由高度纯化的单个蛋白组成，否则A280蛋白测定最适合于提供总蛋白浓度估计的快速评估。

比色分析

比色试剂的使用往往提供比A280更高的灵敏度测定。标准协议通常要求相对于蛋白质的大量过量工作试剂，以确保从蛋白质样品中产生最大的信号。下面介绍两种比较常见的比色试剂。

BCA化验

比色法是在碱性条件下，利用蛋白质中的肽键将Cu2+还原为Cu+。然后铜+离子与两个BCA分子螯合，产生在562纳米处强吸收的紫色络合物。BCA测定法使用与老的Lowry测定法相同的原理，并进行了修改，使其在碱性条件下形成更稳定的检测试剂，只需要单步过程。尽管信号产生与暴露在水环境中的蛋白质肽键的数量成正比，BCA测定比UV光谱方法受蛋白质结构变化的影响更小。该试剂与许多用于蛋白质增溶的表面活性剂兼容。

BCA分析需要与样品同时运行的标准曲线(图4)和必要的孵育步骤。BCA测定法与铜螯合剂、高缓冲容量的缓冲剂和还原剂不相容。图4显示，BCA检测相对于原生蛋白在A280处的吸光度具有更高的灵敏度。

图4。用天然吸光度A280和比色试剂BCA校准牛血清白蛋白(BSA)的曲线。使用BioTek的Epoch微板阅读器在Take3微板附件上对2ml样品进行微体积分析。

布拉德福德化验

用考马斯亮蓝G-250染料比色Bradford法可快速测定蛋白质浓度。在酸性溶液中，染料呈带负电荷的红色形式，将电子提供给蛋白质的可电离基团，导致蛋白质的部分变性。然后染料的疏水部分结合到暴露的疏水袋上，带负电荷的区域与附近带正电荷的蛋白质胺基形成离子键。这导致可见的转变为稳定的蓝色形式，吸收光谱最大值在595 nm，表明在溶液中的蛋白质水平。

Bradford法比前面提到的BCA法更快、更稳定，但是，反应会随着蛋白质组成的不同而变化，容易受到干扰，并且容易因洗涤剂和缓冲液浓度升高而形成沉淀物。该方法需要使用标准曲线，与样品同时运行，由于在蛋白质浓度非常高时存在非线性，因此可能需要样品稀释以适应该方法的线性范围。

微体积原位BCA分析

微体积法使用一种修改的协议，要求将蛋白质和BCA工作试剂的相对浓度从BCA工作试剂与蛋白质的20:1体积比改变为1:1的比例，可以相对于基于微板或比色皿的测量改变BCA校准曲线的工作范围。Take3平板特别适合这种修改后的方案，因为样品和工作试剂可以依次直接添加到Take3平板的微斑点上，并在其中进行反应孵育和随后的分析。这种“原位”分析工作流程(图5)很简单，类似于典型的微板分析工作流程，即试剂和样品依次添加到微板孔中，而不需要离线显色。这大大提高了易用性。此外，由于只消耗2 μL的样品，这促进了样品的保存。

图5。微量BCA分析的原位工作流程，使用1:1的BCA工作试剂与样品的比例，并使用Take3附件。总检测量为4 μL。

与标准20:1协议相比，原位工作流程提供了两个主要优势。首先，测定量仅为4 μL，反应动力学快;与20:1协议中通常建议的2小时相比，反应在不到30分钟内完成。此外，由于BCA试剂显著减少了蛋白质稀释，从而提高了检测的灵敏度，这将动态范围扩展到更低的蛋白质浓度，定量的极限约为0.01 mg/mL BSA(图6)。

图6。将原位检测与微量离心管中BCA工作试剂与BSA标准品的体积比20:1进行微量体积分析比较。

蛋白质纯度评估

除了蛋白质定量，蛋白质纯度的评估对下游应用是必不可少的。A260/A280比值，即样品在核酸吸光度峰(A260)处测量，再在蛋白质吸光度峰(A280)处测量，通常用于近似核酸纯度。这种测量方法也可用于估计蛋白质纯度，0.60的比率通常表示纯蛋白质样品。

如表3所示，在估算蛋白质纯度时，非常低水平的核酸污染会对A260/A280比值产生很大影响。如果结果显示纯度为95-99%，则通常认为蛋白质是纯的，这取决于下游应用。蛋白质纯度的确认可以通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析来实现，或者更灵敏的银染色方法可以用来确定蛋白质在极低浓度下的纯度。

表3。从不同的DNA/蛋白质混合物的光谱数据计算精度测定的百分比。DNA和蛋白质的消光系数分别为50 ng/μL/OD和0.667 μg/μL/OD，以百分准确度表示。

最佳实践

• 测定方法应最适合于样品类型和条件。
• 使用适当的预防措施保护样品免受外来碎片和污染。
• 重复样本测试提高了结果的可信度。
• 比色蛋白测定每次测定都需要标准曲线。
• 当工作在微板格式，选择平底和光学清晰的板。

通过BioTek的微板仪器进行蛋白质定量

BioTek有许多基于微板的仪器，用于蛋白质的吸收和荧光测量。

有关蛋白质定量方法，小体积测量或BioTek的微生物板阅读器的更多信息，请联系您的当地代表或bio.customercare@agilent.com．