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生命科学中的多重分析

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简介

50年前，随着胰岛素放射免疫分析(RIA)的发展，生命科学中的分析开始大步前进。[131I]-胰岛素竞争性免疫分析法提供的敏感性首次允许定量的生理相关水平的胰岛素[1]。70年代中期单克隆抗体和酶联免疫吸附测定法(elisa)的发展进一步推动了测定法在生命科学研究和临床环境中的应用。30年后，据估计，仅在2006年，仅在美国就进行了大约7亿次免疫诊断测试(ELISA和其他形式的免疫分析)。

主要是临床诊断行业引起了对多重检测的兴趣，即可以对同一样品进行多个测试或“小组”。明显的好处包括减少分析时间，更快地提供数据，以协助疾病诊断，更少的样本，特别是侵入性程序(即血液样本)，以及减少人工和化验成本。然而，互补DNA (cDNA)微阵列技术的商业化最初是在1995年开发的，用于疾病状态的差异基因表达分析(图1)，其中多路复用作为一种工具开始起飞。cDNA微阵列通常包含数千个寡核苷酸，用于杂交捕获从样本mRNA转化的cDNA，并用于研究应用。

图1．使用cDNA阵列进行差异基因表达分析的实验工作流程。红色斑点表示相对于对照，实验(即疾病)细胞群中的基因过度表达;黄点表示实验和对照组基因表达相等;绿点表示相对于对照组，实验细胞群中基因表达不足。

然而，最近一些微阵列产品已经获得临床批准，例如罗氏的AmpliChi乐鱼平台入口p CYP450多重分析[4]，用于根据两种细胞色素P450异构体的多态性和突变31-plex分析来分割患者人群的药物剂量。在基因芯片[5]问世之后，基因芯片很快被应用于蛋白质分析。
过去十年见证了多路复用技术的爆炸式发展。也许最成功的商业技术是Luminex xMAP®。该技术使用普遍存在的96孔微孔板进行分析，因此可以使用广泛的实验室仪器来促进和自动化分析。此外，使用xMAP技术的产乐鱼平台入口品已被开发用于广泛的应用，包括基因分型和定量基因和蛋白质表达分析。目前，Luminex已经安装了超过6000台仪器，并通过超过45家合作企业销售研究和临床诊断试剂产品。乐鱼平台入口

本白皮书的目的是提供多路复用分析的概述，并比较执行类似应用的一些技术。它的目的不是覆盖所有，而是强调商业上最相关的多路复用技术。多路复用测试将分为非常高(> 10,000 plex)、高(500≤plex≤10,000)、中等(plex < 500)和低密度(plex≤5)多路复用能力。

超高密度多路检测(> 10000 -plex)

寡核苷酸阵列

基于阵列的多路复用超过10,000个分析仅限于适用于涉及全基因组的分析的寡核苷酸杂交方法。正如引言中提到的，用于差异基因表达的cDNA阵列已经在商业上使用了十多年。新的应用包括全基因组关联研究，以绘制单核苷酸多态性(SNPs)及其与疾病[7]的关系，以及比较基因组杂交(CGH)，一种用于研究染色体变化的技术，主要用于癌症研究[8]。图2展示了安捷伦基于寡核苷酸阵列的CGH (aCGH) DNA微阵列。通常，数十万编码和非编码人类序列在阵列上表示为单个微点。

图2．安捷伦aCGH DNA芯片是一种非常高密度的基于寡核苷酸阵列的CGH芯片

阵列扫描仪需要复杂的数据分析软件来获取和处理阵列的图像。该仪器通常使用扫描激光与基于ppmt的检测相结合，以提供具有微米空间分辨率的高分辨率图像，用于分析非常高密度的阵列。用于标记和杂交步骤自动化的仪器仪表可从许多供应商获得，在某些情况下，能够自动化和检测[9]的平台。

第二代测序

DNA测序的过程通常不被认为是一种分析，然而核苷酸碱基的调用及其在基因和基因组其他部分中的位置是一种定性分析。第二代测序技术，如来自454 Life Sciences的焦磷酸测序或“合成测序”，能够在合理的时间框架和成本内对整个基因组(DNA)和转录组(mRNA)进行测序——随着每项新技术的发展，这两个属性正在不断降低。第二代测序技术由许多其他供应商提供，如Illumina和Life technologies，但可以说，454焦磷酸测序技术是市场领导者。454公司的基因组测序FLX仪器可进行大规模多路复用，通常超过100万plex。
其焦磷酸测序技术利用核苷酸合并的焦磷酸最终产物通过酶转化[10]产生化学发光读出。多路复用是通过使用用于捕获DNA样本序列特定片段的单个珠子来提供的。然后将这些珠子装载到PicoTiterPlate设备上进行测序。PicoTiterPlate孔的直径允许每个孔只能容纳一颗珠子，但PicoTiterPlate上有超过一百万个孔。

在添加测序酶之后，基因组测序FLX仪器的流体子系统以固定的顺序将单个核苷酸流过数十万个每个含有一个珠的孔。加入与珠子上DNA片段互补的核苷酸会产生CCD相机记录的化学发光信号(图3)[11]。

图3。454生命科学基因组测序FLX系统和使用珠子和PicoTiterPlate的“合成测序”过程。

二代测序的全基因组测序能力与寡核苷酸阵列相比具有竞争力，因为它们提供了相似的信息，但测序的准确性优于阵列[12]。虽然全基因组测序不会完全取代寡核苷酸阵列，但第二代测序正在迅速改变遗传学的格局，提供了以迄今难以想象的速度回答问题的能力。

噬菌体展示

噬菌体显示代表了多路复用的终极能力。通常使用该技术可以探测超过1010种可能的蛋白质-蛋白质相互作用。所使用的分析方法不是定量的，而是依赖于结合的定性鉴定。后续elisa通常用于量化特异性和结合亲和力，尽管Biacore等无标签技术越来越多地使用。今天，主要应用之一是抗体的生成:在最近的出版物中，噬菌体显示库提供了超过1.1 x 1010种不同的单链抗体，已用于针对292种抗原的筛选活动，导致超过38,000个重组抗体的选择，筛选和测序，产生超过7200个独特的克隆[14]。

图4。噬菌体展示周期显示噬菌体表面表达的克隆的选择。分析(特异性和结合亲和力)通常由ELISA或无标签技术确定。

高密度多路检测(500≤plex≤10,000)

细菌人工染色体阵列

阵列CGH技术已经开发出来，使用细菌人工染色体(BAC)克隆提供全基因组覆盖，但不需要成千上万的寡核苷酸。BAC克隆的间隔约为1兆酶，因此整个人类基因组可以被数千个克隆所覆盖。基于BAC阵列的CGH被许多临床遗传学实验室用于诊断癌症和出生缺陷，但基于寡核苷酸阵列的CGH被认为是大规模基因组学研究的更好选择，主要是因为它比BAC阵列[15]提供了更高的分辨率。

蛋白质阵列

这种密度水平也为蛋白质分析物的多重分析开辟了道路。例如，蛋白质-蛋白质的相互作用可以用纯化的蛋白质和高密度蛋白质芯片来探测，这些芯片含有几千种不同的蛋白质，打印在涂有硝化纤维的载玻片[16]上。荧光检测是通过使用克隆到感兴趣的蛋白质中的表位标签和针对表位标签的荧光抗体来实现的。

图5。使用Invitrogen公司的ProtoArray®人类蛋白质芯片v4.0识别蛋白质-蛋白质相互作用的工作流程。

多路复用密度的降低和只使用一种颜色的荧光倾向于简化分析，减少扫描仪的规格限制，从而降低仪器成本。

中密度多路检测(plex < 500)

Bead-based数组

提供这种水平的多路复用能力的技术种类繁多，而且每年都有新技术被开发出来。在多路复用的这个层次上，微阵列格式就不那么吸引人了。正如引言中所讨论的，基于珠的Luminex xMAP技术和相关的xTAG技术(Luminex专有试剂平台)在商业上是最成功的。在过去的十年中，xMAP技术已经成为Luminex合作伙伴开发大量多路检测板的基础。用于研究和临床前药物发现的分析包括免疫分析、集中定量基因表达、基因分型和过敏原检测，由19个Luminex合作伙伴提供;用于临床诊断的分析包括用于自身免疫和传染病检测的小组，以及用于器官移植诊断的分子组织相容性分型，由28个Luminex合作伙伴提供。

Luminex本身现在提供fda批准的囊性纤维化易感性检测的体外诊断试剂盒，包括单SNP检测面板，以评估使用xTAG技术在囊性纤维化跨膜电导调节基因中确定的突变或变异。fda批准的xTAG产品线增加了xTAG呼吸道病毒面板，用于在最近纽约长岛地区[17]爆发的猪流感(H1N1)中对流感进行基因分型。xTAG产品线目前正在进行大量用于药物基因组学应用的细胞色素P450同工酶开发面板。

基于珠子的xMAP技术的流行源于以下几个属性:

1 - 100分析的多路复用能力涵盖了许多应用的多路复用分析的理想或实际范围
多路复用格式是非常灵活的，允许选择一个几乎无限的组合分析，以多路复用;这对于平面阵列来说是不正确的，因为平面阵列的分析选择是固定的
用传统的化学方法和方法将生物成分结合到珠子上很简单
反应动力学涉及珠在溶液接近液相速率提供较少的实验培养时间相对于平面阵列
可以使用普遍使用的廉价手动或自动设备移液，并在传统的微孔板(96或384孔密度)中进行分析。

最初的技术是基于用两种染料的严格调节组合浸渍聚苯乙烯微球，以提供多达100种不同类型的珠子，可以通过它们的荧光来区分。附着在珠表面的抗体或寡核苷酸等生物含量为开发检测提供了手段。检测是通过使用生物素及其高亲和伙伴链霉亲和素与藻红菊酯标记。Luminex阅读器基本上是一个双色流式细胞仪，其中从微孔板中提取珠粒，并通过鞘流夹带到一个小的检测体积中，其中检测类型由红色激光探测，检测结果由单独的绿色激光探测。

图6．A - C:建立Luminex xMAP检测方法;D - F:分析物和测定类型的检测方法

xMAP技术的最新发展包括磁性微球和FLEXMAP 3-D的引入。这两项技术的发展都提高了样品的通量:磁性微球通过允许磁铁在去除未结合的试剂和样品基质所需的洗涤步骤中固定微球来辅助检测的自动化;FLEXMAP 3-D仪器的分析速度大约是Luminex 200仪器的两倍。FLEXMAP 3-D还具有多路复用多达500个分析的能力。

抗体阵列

中密度蛋白阵列最常见的格式之一是使用硝化纤维膜的抗体阵列来定量蛋白质，即细胞因子。抗体阵列的工作流程类似于夹心elisa，其中一抗被固定在硝化纤维膜上，然后连续添加分析物和标记的二抗到分析物中创建分析。由于抗体交叉反应性[18]的问题，多路复用水平通常限制在< 50 plex。抗体阵列可以用大多数商业上可用的“顶置”光源DNA阵列扫描仪进行扫描，该扫描仪适用于标准的显微镜载玻片。不能使用底部光源的扫描仪，因为与抗体阵列一起使用的硝化纤维涂层会干扰仪器的信号检测系统。

反向数组

反向数组，顾名思义，将样本排列在一个表面上。通常，从细胞系、组织样本或体液产生的裂解物以微点印迹格式排列。该方法为同时测定大量生物样品中的蛋白质表达水平提供了一个新的平台。

一种常见的反向阵列检测方法涉及标记二抗体的酶比色检测。数据，被视为稀释曲线系列，提供了一个敏感的，定量的，和更高的通量替代Western blotting。反向阵列可以提供中密度和高密度多路复用，这取决于点阵仪器处理被放置在点阵膜上的粘性样品的能力。中密度似乎是最常见的格式。

图7。反向阵列图像来自Aushon Biosystems[19]。

质谱分析

一种最初为有机化学家开发的不同技术，现在正用于生命科学中的多路复用分析。90年代电喷雾(ESI)和基质辅助激光解吸(MALDI)电离技术的发展使得质谱仪(MS)被用于生物分子的分析。特别是ESI，与液相色谱结合使用作为前端分离技术，是一种非常有用的电离源，用于蛋白质表达分析和蛋白质片段的多重反应监测，通过胰蛋白酶消化蛋白质或药物小分子代谢物从细胞裂解物和体液样本[20]。质谱法也是多路复用其他类型分析物的基础。Sequenom使用质谱技术进行SNP基因分型，其iPLEX®Gold技术可在单孔[21]中多路复用多达40个SNP。

低密度多路检测(plex≤5)

定量聚合酶链反应

低密度的多路复用通常通过多个荧光团的光谱分辨率或使用检测模式的组合来实现。定量PCR是基因分型、基因筛选最常用的技术之一，与逆转录酶结合从mRNA中生成cDNA，用于研究应用和临床诊断的基因表达分析[22]。通过对荧光团的明智选择，在一个反应管中使用适当的引物对可复用多达5个不同的基因。常见的公共领域染料如FAM, JOE, TAMRA, ROX, Texas Red等都已用于多路复用。多重PCR需要大量的多重PCR反应优化，以确定引物浓度、DNA模板浓度、PCR循环条件和PCR缓冲成分。广泛提供的热循环试剂可用于定量PCR。

微型板块化验

微孔板分析正逐渐变得多样化，特别是在临床前小分子药物发现的ADME/Tox领域。一个例子是用于在微量滴度板[23]的单孔中测量三种不同caspase活性的三倍效测定法。半胱天冬酶是一组参与细胞凋亡和炎症的半胱氨酸蛋白酶。该研究利用铕、钐、铽和镝螯合物在荧光寿命和发射波长方面的不同荧光特性，建立了基于均匀时间分辨荧光淬灭的caspases 1、3和6在同一微孔板中的测定方法。许多多模式微孔板阅读器能够使用时间分辨荧光检测模式和适当选择的光谱滤波器和集成时间延迟进行三重分析。

基于细胞的微孔板分析也逐渐变得更加多样化。一种常见的多重检测方法使用了以活细胞格式读出的测量方法，然后在相同的细胞上进行细胞活力检测。最近在巴尔的摩的ISSX会议上提出了这种类型的分析的一个例子，2009[24]。使用DPX-2细胞，基于含有荧光素酶链接的细胞色素P450, 3A4同工酶启动子报告结构的人肝癌细胞系，可以通过发光检测来监测同工酶的诱导和活性。然后使用荧光测量确定细胞活力，并用于标准化数据。

图8。使用荧光读出法测定CYP3A4诱导(ONE-Glo)和活性(P450-Glo)，使用荧光读出法测定DPX-2细胞的细胞活力(CellTiter Fluor)，并使用利福平剂量。

结论

自90年代中期cDNA阵列的发展以来，多路复用分析技术正在以越来越快的速度发展。微阵列技术似乎最适合于基因组或蛋白质组的广泛应用，其中读出是定性或差异的，尽管第二代测序技术开始取代阵列在这一应用领域。基于珠的技术被用于更集中的应用，如分析特定的信号转导途径或与疾病相关的多种生物标志物。当分析物是mRNA或蛋白质时，读数通常是定量的。质谱，特别是与液相色谱相结合的质谱，作为蛋白质和小分子代谢物分析的一种多路复用工具正在获得认可。LC-MS/MS是后一种应用的首选工具。对于有限的多路复用应用，有广泛的检测方法可供选择，但定量PCR似乎是基因分型或基因表达的首选方法。微孔板分析，特别是那些涉及基于细胞的ADME/Tox分析，正在开始探测多个事件，以节省时间和人力，并产生更有意义的数据。

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