光学显微镜的发展

作者:Peter Banks博士，安捷伦科技有限公司

托勒密和光折射

光学显微镜一般是通过光线的折射来工作的。当光从一种介质传到另一种光密度不同的介质时，就会发生折射。人们可以通过简单地把一个长物体放在水里，比如一根笔直的木棍，让物体的一部分在水里，另一部分在空气中，来观察折射。根据我们的视力，木棍看起来是弯曲的(图1)。

图1所示。折射作用……

当然，杆子在物理上并没有弯曲，但进入我们眼睛的光线从水(折射率= 1.33)进入空气(折射率= 1.00)时会弯曲。因此棍子看起来是弯曲的!希腊罗马时代的克劳迪斯·托勒密是第一个意识到这一物理现象的人，大约在2000年前，他将科学数据制成表格，比较了一根直木棍在空气和水中的角度差异(见图2)。

图2。托勒密的折射表

伊斯兰博学多才和光学

一千年前，在伊斯兰黄金时代的鼎盛时期，一对阿拉伯博学多才的学者将光学科学发展得更远。首先，伊本·萨尔在他的论文《关于燃烧的镜子和透镜》中将托勒密关于折射的工作扩展到透镜和抛物面镜。这为Ibn al-Haytham打下了一些基础，他花了十年时间写了一部七卷本的光学专著，Kitab al-Manazir(光学之书)。这项工作的遗产被认为是第一个证明科学观察方法的文献实例，该方法基于经验，可测量的证据-数据!13世纪出版了拉丁文译本，许多著名的西方科学家都阅读了这本书，并对其产生了极大的影响，包括莱昂纳多·达·芬奇和伽利略。

第一台显微镜

虽然从历史上看，阿拉伯科学在文艺复兴时期及以后促进了欧洲的科学方法，但尚不清楚伊本·萨尔和伊本·海瑟姆的工作是否启发了第一台显微镜的发展。据认为，第一台显微镜是由一个目镜和物镜组成的复合设计，大约在16世纪末由Hans和/或Zacharias Janssen开发。撒迦利亚斯是一个相当可疑的科学家/发明家，因为他多次因伪造硬币而被捕，他的发明声称在不一致中蒙上了阴云。无论真相如何，詹森被广泛认为是第一台望远镜的发明者，如图3所示。

图3。杨森显微镜。中心管允许扩展移动物镜从目镜允许放大之间3倍- 10倍。

相比之下，安东尼·范·列文虎克(Antonie van Leeuwenhoek)和约半个世纪后的罗伯特·胡克(Robert Hooke)的作品无可争议，意义重大得多。每个人都发明了自己的显微镜，并利用它们进行新的科学发现，但胡克是一个真正的科学家;而范·列文虎克是一个布商。

胡克和显微摄影法

胡克是牛津大学基督教堂的产物，在那里他与伦敦圣保罗大教堂的著名建筑师克里斯托弗·雷恩等名人有过接触。当时与他同时代的正是罗伯特·波义耳和艾萨克·牛顿。在牛顿的同一时期，他们都推导出了定义力学方面的基本力方程:

胡克定律:F = -kx;

牛顿第二运动定律:F = ma。

但从显微镜的角度来看，胡克因其在皇家学会赞助的初创期刊物上发表的《显微摄影》而闻名。皇家学会是一个有350多年历史的科学资助组织，今天资助科学研究的金额约为4200万英镑。胡克的缩微图中有一些常见的刺激物的插图，比如虱子和跳蚤——17世纪的时候，也许每个人都被这些害虫折磨过。胡克的艺术和他的科学说明了这些害虫(见图4)，让广大观众高兴，尽管仍然抓挠……

图4。胡克手绘的缩微图:左边是虱子，右边是跳蚤。

胡克使用复合显微镜获得了这些引人注目的图像，他作为艺术家的才能忠实地复制了这些图像。他的显微镜比杨森显微镜的放大率提高了约30倍。然而，作为他遗产的一部分，他创造了“细胞”这个术语，用来描述在他的显微镜下可见的软木塞中的“隔间”(见图5)。

图5。胡克复合显微镜的复制品:注意靠近底座的线，可以聚焦。

Van Leeuwenhoek和微生物

列文虎克并不是训练有素的科学家。然而，他在显微镜科学方面的成就，无论是放大的能力还是发现新的生物学，都超过了胡克的贡献。他甚至没有用复合显微镜!范·列文虎克对布料上的图案有商业兴趣，并以极大的兴趣阅读了胡克的《显微摄影法》。这种兴趣和对玻璃加工的熟悉导致了一种相当独特的能力，即制造高质量的透镜，提供超出胡克所能完成的放大倍数。目前尚不清楚他是如何制作透镜的，但人们认为他使用了胡克所描述的方法，即绘制加热的钠石灰棒，并通过重新加热绘制的一端来创建一个球形玻璃球(图6)。据推测，范·列文虎克还将这些球磨碎，以提供他的显微镜的高倍倍数。

图6．胡克的透镜制作配方。

范列文虎克透镜提供了惊人的高达300倍的放大倍数，比胡克透镜高出10倍!整个设备可以很容易地隐藏在一个人的手掌(图7)。它更像一个放大镜而不是显微镜。

图7。设备特写。

图7 b。现代用户。

在显微镜放大倍数的帮助下，列文虎克有了惊人的发现，他在给皇家学会的一系列信件中描述了这些发现，而不是发表。他的第一封信中有两封信描述了他在一滴池塘水中和他牙齿上的浮渣中发现的“微生物”。我们现在知道这些微生物是滴虫。列文虎克对如此小的样本中这些微生物的数量感到惊讶。他说:“我口中的这些话，比全国的人还多。但当时，英国皇家学会的科学家们认为，列文虎克一定是犯了实验错误，因为这样的小生物生活在水中，甚至更糟，生活在人的嘴里被认为是荒谬的。英国皇家学会召集了一个特别委员会来调查这项工作，最终为列文虎克完全正名。三年后，他被选入英国皇家学会。列文虎克总共给英国皇家学会写了190封信，描述了他的显微发现，包括白细胞和红细胞、精子、肌肉纤维和细胞结构的各个方面。但他从未发表过任何研究结果。 The letters remain in the Royal Society Library.

阿贝限制

范·列文虎克对他的镜头制作方法极其保密，他的秘密也随着他的去世而消失。在接下来的几个世纪里，显微镜在很大程度上受到限制，其分辨率与胡克的复合显微镜相差无几。19世纪末，恩斯特·阿贝(Ernst Abbe)为提高显微镜放大物体的能力做出了巨大贡献。他曾作为光学理论家为卡尔·蔡司工作，并最终成为蔡司公司的合伙人。他发明了消色差透镜，减少了显微镜中使用的透镜的色差和球差。他还假设了阿贝正弦条件，详细说明了透镜形成清晰图像的必要条件。他最著名的成就可能是对放大倍率的固有极限有了更清晰的理论理解，这被称为阿贝极限或显微镜的分辨率极限，由光的波长和所用透镜的数值孔径决定:

，其中d为可能的空间分辨率，λ为光的波长，NA为数值孔径。

当阿贝开始与玻璃化学家奥托·肖特(Otto Schott)合作，并使用水浸泡等技术来提高NA，从而实现了用于照明的光波长的一半左右的空间分辨率时，他就可以生产具有数值孔径接近1的物镜系统的显微镜。这种分辨率是微米的几分之一，并且允许比范列文虎克实现的放大倍数显著更高。此外，蔡司和阿贝在19世纪后期生产了许多科学家都能买得起的显微镜，广泛地打开了基于显微镜的研究。

图8。蔡司显微镜约1877年。

Zernicke和相位对比

上图中的蔡司显微镜也被称为亮场显微镜，其中白光被用来照亮样品。观察样品中不同特征的能力是由样品中光密度的差异提供的:吸收更多光的特征会更暗;那些吸收更少，更轻。不同的光密度在样品中提供了我们可以辨别的对比。光场显微镜的光学相对简单，因此便宜，在整个20世纪和今天被广泛发现在许多实验室。然而，有些样品吸收光的能力很差，或者整个样品的光密度差异很小，导致显微图像对比度差，导致难以分辨样品中的任何特征。对于细胞成像来说，这当然是正确的。阿贝的进步使显微镜具有观察这些微小生命单位的分辨率，通常大小从大约一微米(即细菌)到几十微米(典型的哺乳动物细胞)，但由于整个细胞缺乏显著的光密度，导致对比度差，因此很难观察细胞结构。

光在光场显微镜下通过样品透射可能会被吸收、散射或相移。后一个过程是由光通过不同介质时速度减慢引起的。在阿贝研究成果的基础上，荷兰科学家弗里茨·泽尼克(Frits Zernicke)在1938年第二次世界大战前夕发明了一种明场显微镜，可以测量光照穿过样品时的相移。当时，欧洲似乎每个人都被战争的威胁所困扰，泽尼克的发展并没有因为其极大地提高透明样品成像对比度的能力而得到认可(图9)。具有讽刺意味的是，正是德国的战争努力认识到了泽尼克成就的重要性，并制造了许多完善的相位对比显微镜，证明了该技术的真正用途:能够随着时间的推移监测活细胞。战后，大多数显微镜制造公司采用了这项技术，泽尼克的创新获得了1953年的诺贝尔物理学奖。

图9。细胞的图像比较-左:亮场，右:相位对比。

荧光显微镜

在相衬显微镜之前，细胞是通过使用各种染色剂来观察的。核染色始于150多年前，随后是银染色，在20世纪初，苏木精和伊红分别用于碱性和酸性染色，以区别染色细胞的细胞核和细胞质。在同一时期，从乔治·斯托克斯开始，研究了物质的荧光性质。虽然通过引入吸收光的发色团，着色剂可以在样品中提供良好的对比度，但由于发射量与光源强度成正比，因此通过使用荧光可以获得更高的样品对比度。关键当然是要有合适的光源。

August Köhler因Köhler照明而闻名，他还于1904年在蔡司建造了第一台紫外线显微镜。他的意图是提高空间分辨率，因为阿贝极限要求通过使用更小波长的照明来提高分辨率。使用的光源是镉弧光灯，可以以可见光显微镜两倍的分辨率对物体进行摄影再现。Köhler还指出，一些物体在紫外线照射下发出更长的波长的光，但正是奥斯卡Heimstädt在1910年利用这一观察作为建造第一个成功的荧光显微镜的基础。

当时，这种显微镜更多的是一种好奇心，而不是一种有效的科学工具，因为它依赖于样品的固有荧光和显微镜设计中的背景信号限制。Heimstädt他自己在他的出版物中总结说，荧光显微镜的未来是不确定的。

令人高兴的是，Heimstädt工作的局限性在接下来的几十年里得到了解决。一种名副其实的荧光探针已经专门为细胞生物学目的开发，包括插层染色，活性染料，荧光标记抗体(基于Albert Coons的开创性工作)和绿色荧光蛋白家族(主要归功于Roger Tsien的工作)。利用这些探针，几乎可以对细胞中的任何生物分子进行成像并研究其功能。仪器背景信号的限制通过两项发展得到了解决:首先，1929年Ellinger和Hirt开发了一种外射荧光几何结构;随后在60年代，主要由约翰·普洛姆发明了二向色镜，它可以透射某些波长的光，同时反射其他波长的光。这两种硬件创新加上荧光探针的可用性使荧光显微镜成为细胞生物学家不可缺少的工具。

图10。一种基本的荧光显微镜，展示了一种外延荧光设计，加上隔离激发和发射光的光谱过滤器和一个二向色镜，将激发光(蓝色)反射到样品上并远离探测器，同时允许发射光(红色)通过探测器。

共焦显微镜

细胞生物学是三维的。当推动阿贝极限以看到细胞和组织切片中更精细的结构时，由于显微镜物镜的宽照明场和景深限制，图像可能出现失焦。1955年，马文·明斯基(Marvin Minsky)找到了一种解决宽视场荧光显微镜常见的失焦问题的方法。他的基本前提是用一对针孔来限制样品的照明场和样品内的探测深度。

这个基本概念如图11所示。与激励源一起使用的针孔将样品的照明限制在由针孔孔径大小定义的点上。此外，放置在探测器前面的第二个针孔限制光到达探测器，只有焦平面。因此，两个针孔一起工作有效地限制了样品荧光的视野到焦平面上的一点。明斯基随后提出，为了创建具有所需视野的标本图像，将一系列图像进行光栅扫描以创建合成图像。

图11。宽视场与共聚焦荧光的比较。共聚焦几何中使用的两个销孔将视场限制在焦平面上的一个点上。

明斯基在1961年为共聚焦显微镜申请了专利。不幸的是，直到明斯基的专利到期，技术才跟上他的概念。与明斯基的概念存在争议的是由一对针孔引起的视野限制。在他申请专利的时候，还没有足够功率的光源来产生足够的荧光信号，使共聚焦概念能够工作。70年代第一台激光器的出现解决了这个问题，1987年第一台商用仪器问世。随着软件的发展，允许三维视图的细胞和组织(见图12)光栅扫描多个焦平面(即切片)通过物体，激光扫描共聚焦显微镜起飞。

图12。共聚焦显微镜下单个U937细胞的两张视图:左边是整个细胞的3D表示(以0.3微米的间隔共记录54个切片);右图中，细胞质(红色)已被电子剥去，露出细胞核(蓝色)和类核体(绿色)。

数码显微镜

数字时代始于1947年晶体管的发明。摩尔定律在过去四十年中准确地预测了在集成电路中装入越来越多的晶体管的能力，从而提高计算能力，同时降低制造成本。今天，大多数技术都是基于数字的，显微镜也不例外。第一台数码显微镜是由日本Hirox公司开发的，他们用数码相机和显示器取代了望远镜。常规光学显微镜的放大率是目镜和物镜放大率的乘积。目镜式望远镜通常提供10倍的放大倍率，而最高功率的物镜可以提供100倍。因此，这些显微镜可以将物体放大1000倍左右，这样一个20 μm的ID细胞通过望远镜可以看到2厘米大小。数码显微镜的放大效果与数码显微镜有很大不同，数码显微镜放大后的图像可以放大，显示在电脑显示器上，甚至可以投影。使用标准投影仪，可以很容易地将细胞的数字图像作为2米宽的图像投影到屏幕或墙上，提供10万倍的放大倍率。

数字显微镜的其他吸引人的特性是显示器显示，多个用户可以同时查看图像，以及图像的可移植性，捕捉到的图像可以作为TIF文件下载，并在任何人的笔记本电脑上查看显微镜。现代数字显微镜使用自动程序进行图像捕获和图像分析，使显微镜术成为研究和工业科学家非常简单的过程。这些显微镜通常不能立即识别出来，因为它们没有望远镜，通常也没有可见的平移台或聚焦旋钮。他们也能够处理样品容器，而不是显微镜载玻片。培养皿，培养瓶和不同密度的微孔板(6- 384孔密度)现在启用。

BioTek的数字显微镜家族包括这两种Cytation™3和5。这些仪器不仅可以进行显微镜检查，还可以通过广泛的光学检测技术(包括分光光度法、荧光和发光)对细胞进行定量分析，这些技术与ppm基微孔板阅读器相同。我们产品家族的最新成员，Cytation 5(见图13)结合了本论文中讨论的许多发展，包括荧光，颜色和相位对比显微镜。

图13。Cytation 5细胞成像多模式阅读器。该数码显微镜提供宽视场荧光和亮场，组织学应用的彩色亮场(H&E染色)和相位对比成像细胞无需染色或荧光探针。