活性氧物种简介-细胞中活性氧的测量

活性氧(ROS)一直被认为是免疫细胞对微生物入侵的杀伤反应的组成部分。最近的证据表明，ROS在正常细胞信号转导和细胞周期中发挥着关键的信使作用。这些活性分子由许多不同的机制形成，可以通过各种技术检测。在这里，我们简要地描述了这些分子背后的生物学原理以及检测它们的方法。

简介

活性氧(ROS)是一个短语，用来描述从分子氧衍生出的一些活性分子和自由基。氧基自由基的产生是所有需氧物种的祸害。这些分子是有氧呼吸过程中线粒体电子传递或氧化还原酶和金属催化氧乐鱼平台入口化过程中产生的副产物，有可能导致一些有害事件。最初认为只有吞噬细胞在宿主细胞防御机制中负责ROS的产生。最近的研究表明，ROS在细胞信号传导中起作用，包括;细胞凋亡;基因表达;激活细胞信号级联[1]。值得注意的是，ROS可以作为细胞内和细胞间的信使。

活性氧种类

大多数活性氧是在线粒体电子传递过程中产生的副产物。乐鱼平台入口此外，ROS是金属催化氧化反应的必要中间体。氧原子有两个未配对的电子，在外层电子层的轨道上。这种电子结构使氧容易形成自由基。通过电子的加入，氧的顺序还原导致了一系列ROS的形成，包括:超氧化物;过氧化氢;氢氧自由基;羟基离子;还有一氧化氮。(图1)。

图1所示。常见活性氧的电子结构。每个结构都有它的名称和化学式。红色•表示未配对电子。

细胞对ROS的防御

活性氧的解毒对所有需氧生命形式的生存至关重要。因此，许多防御机制已经进化来满足这一需求，并在ROS的产生和清除之间提供平衡。向促氧化状态的不平衡通常被称为“氧化应激”。

细胞具有多种防御机制来改善ROS的有害影响。超氧化物歧化酶(SOD)催化两个超氧化物阴离子转化为过氧化氢分子(H₂O₂)和氧(O₂在真核细胞的过氧化物酶体中，过氧化氢酶将H₂O₂谷胱甘肽过氧化物酶是一组含硒的酶，它也催化过氧化氢和有机过氧化物降解为醇。

有许多非酶小分子抗氧化剂在解毒中发挥作用。谷胱甘肽可能是最重要的细胞内防御活性氧有害影响。这种三肽(谷氨酰-半胱氨酸-甘氨酸)提供了一个暴露的巯基，作为一个丰富的攻击目标。与ROS分子的反应氧化谷胱甘肽，但还原形式由nadph依赖的还原酶在氧化还原中再生。维生素C或抗坏血酸是一种能够减少ROS的水溶性分子，而维生素E (α-生育酚)是一种脂溶性分子，被认为在细胞膜中起着类似的作用。

氧化形式的谷胱甘肽(GSSG)和还原形式的谷胱甘肽(GSH)的比率是生物体[2]氧化应激的动态指标。

氧化应激反应

活性氧对细胞过程的影响是暴露强度和持续时间的函数，以及暴露的环境。典型的细胞应激反应是离开细胞周期，进入G₀．随着持续暴露和/或高水平的ROS，细胞凋亡机制被触发。在循环细胞中，p21在应激反应中被激活，如氧化剂或氧化应激，并阻止细胞周期进程[4]。同样，p27的产生导致G₁细胞的捕获。在循环细胞中，p53和p21通过诱导视网膜母细胞瘤(RB)的去磷酸化对氧化剂做出反应。暴露于氧化剂如H₂O₂或一氧化氮也会导致RB去磷酸化，这与p53或p21无关。在任何一种情况下，细胞都被阻滞在s期。p27的表达部分由Foxo转录因子控制，已知Foxo转录因子控制参与细胞周期进程、代谢和氧化应激反应[5]的基因的表达。例如，PI3K/Akt通路的有丝分裂刺激使Foxo3a维持在细胞质中，但在缺乏刺激的情况下，Foxo3a进入细胞核并上调氧化代谢和细胞周期阻滞的基因，如p27[5]。在一定条件下Foxo3a可直接激活bim基因表达，促进细胞凋亡。[6]。因此，Foxo3a通过使应激反应能够促进氧化应激下循环细胞的存活，但在条件允许时诱导细胞死亡。非循环细胞，如神经元，也有涉及Foxo3a的氧化应激应对机制。Foxo3a诱导锰形式SOD的表达以应对氧化应激[7]。

ROS产生的调控

吞噬细胞

吞噬细胞刺激产生活性氧最初被称为“呼吸爆发”，因为这些细胞消耗的氧气增加了[8]。这一过程由NADPH氧化酶(一种多组分膜结合酶复合物)的作用催化，对吞噬细胞[8]的杀菌作用是必要的。

虽然有几种酶被认为能够产生ROS部分，但NADPH氧化酶是最重要的[9]。NADPH氧化酶活性受g蛋白Rac[10]的复杂调控系统控制(图2)。

在静息细胞中，由两种多肽(p22-phox和gp91-phox)组成的膜嵌入的异二聚体(p22-phox和gp91-phox)也包含两个血红素基团和一个FAD基团，使电子从细胞质NADPH穿过膜转移到分子氧，而没有NADPH氧化酶活性[9]。

认为当gp91-phox多肽同时作为H+离子通道时，电荷补偿发生。在刺激下，许多多肽(p47-phox, p67-phox和p40phox)转运到质膜的内表面，形成具有NADPH氧化酶活性的全活性酶复合物。类似的过程被认为也发生在非吞噬细胞[11]。

图2。NADPH氧化酶的激活示意图。

信号转导

活性氧在许多细胞过程中都有作用。高水平的ROS可导致细胞损伤、氧化应激和DNA损伤，可引发细胞存活或凋亡机制，这取决于暴露的严重程度和持续时间。一氧化氮(NO)已被证明是细胞间的信使，负责降低血压[12]。在细胞内，ROS物种与抗氧化酶一起，被认为通过类似cAMP第二信使系统[12]的氧化还原信号在打开和关闭酶方面发挥作用。例如超氧阴离子，过氧化氢。•O的稳态水平₂-估计是如此之低，但其活动空间有限。过氧化氢(H₂O₂)在没有催化剂(例如酶，多价金属等)的情况下，通常与硫醇不反应，它与硫酸阴离子(S-)反应，形成亚磺酸，而亚磺酸又电离形成亚磺酸盐(SO-)。这种中间体可以被谷胱甘肽[13]的作用逆转。

有丝分裂信号从细胞表面开始，伴随着受体酪氨酸激酶的配体依赖性激活，它激活了增殖所必需的重要的MAP激酶级联。这些级联导致H的产生₂O₂来自几种酶催化剂，包括NADPH氧化酶[14]据估计，H₂O₂生长因子[15]的增殖需要在纳摩尔水平。过氧化氢与SOS-Ras-Raf-ERK和PI3K/Akt通路通过多种机制相互作用，并以does依赖的方式相互作用(图3)₂O₂，由于Nox1的表达导致重新进入细胞周期的增加，而持续高水平的H₂O₂在长时间阻滞后导致细胞阻滞并最终凋亡。

过氧化物毒素是H₂O₂还有有丝分裂信号。这些硫醇依赖的过氧化物酶被激活并招募到受体，作为有丝分裂刺激的一部分，并用于限制ros相关刺激对有丝分裂原级联[16]下游靶点的影响。(图3)。

细胞周期控制:氧化还原信号

当细胞增殖时，它们经历了细胞生长、DNA复制和有丝分裂的协调过程，即细胞周期。细胞周期是一个严格控制的过程，有几个检查点。这些检查点中的每一个都受到受细胞氧化状态影响的蛋白质和蛋白质复合物的调节。Heintz和Burhans[5]在一篇综述中详细描述了氧化还原状态和细胞周期控制之间的关系。

在多细胞动物中，大多数细胞不复制，并通过终末分化暂时或永久地退出细胞周期。G的退出₀进入G₁细胞外生长因子受氧化剂控制。氧化还原依赖信号通路促进Cyclin D1[17]的表达，Cyclin D1[17]是重新进入细胞周期的关键蛋白。因此，cyclin D1的表达已被报道为成功的有丝分裂刺激[15]的标志。G的关键调节点₁为限制点(或R点)，细胞开始进入s期。在R点，视网膜母细胞瘤(pRB)蛋白被Cyclin D/CDK复合物磷酸化。有趣的是，足够多的研究表明，pRB磷酸化有大约-207 mV的氧化还原电位，超过这个电位细胞的pRB脱磷酸化，细胞停止循环[18]。已经注意到，在同步细胞中，ROS的产生在细胞周期中增加，峰值水平出现在G2/M期[19]。

活性氧在细胞凋亡中起作用。NF-kB是Rel转录因子家族的统称，它通过上调几个抗凋亡基因[17]来抑制细胞凋亡。相反，c-Jun n -末端激酶(JNK)在长时间激活时促进细胞凋亡[20]。延长激活已被证明是由直接暴露于ROS以及灭活JNK抑制剂如MAP激酶磷酸酶[20]引起的。抑制TNF-α诱导的ROS积累似乎是NF-kB下调JNK激活的机制。

图3。已报道的ROS和有丝分裂级联相互作用的示意图。

测定活性氧种类

活性氧的测量依赖于分析目标以及所讨论的活性氧。在细胞水平上，可以从组织培养中单独评估特定的ROS，而在动物水平上，氧化应激的影响通常从血液制品(如血清或血浆)或尿液样本中测量。

氧化应激

谷胱甘肽是最重要的非酶性氧化剂防御机制。它存在于相对较大的量(mM水平)，并用于解毒过氧化物和再生一些重要的抗氧化剂(如α-生育酚和抗坏血酸)[21]。

还原性谷胱甘肽(GSH)通过依赖NADPH的还原酶的作用从其氧化形式(GSSG)再生(公式3)。

Eq。3。GSSG + nadph + h +→2 GSH + nadp +

由于GSSG相对于其合成或分泌的快速减少的性质，GSH与GSSG的比率是细胞内氧化应激的良好指标。谷胱甘肽和GSSG水平可通过HPLC[22]、毛细管电泳[23]或微板生化[24]测定。

已经设计了几种不同的测定方法来测量样品中的谷胱甘肽。通过将荧光素衍生物与谷胱甘肽s -转移酶结合使用，谷胱甘肽的量将与在后续步骤[25]中添加荧光素酶时产生的发光信号成比例。在谷胱甘肽还原酶的存在下，谷胱甘肽与DTNB (Ellman试剂)反应可比色法测定总谷胱甘肽。谷胱甘肽还原酶将GSSG还原为GSH, GSH与DTNB反应生成黄色的5-硫代-2-硝基苯甲酸(TNB)，在412 nm处吸收。

谷胱甘肽的亚细胞检测和定位对于理解细胞氧化还原状态的调节、药物的作用和解毒机制是重要的。此外，已经报道了细胞亚群中GSH水平在氧化应激反应中的差异，强调了适用于流式细胞仪和自动荧光检测的检测方法的重要性。

双烷化合物单溴比马烷和单氯比马烷在结合之前基本上是不荧光的，它们很容易与低分子量硫醇(包括谷胱甘肽)反应形成荧光加合物，激发波长为394 nm，发射波长为490 nm[26](图4)。这些试剂可用于检测二硫化物化学还原前后蛋白质硫醇在细胞中的分布。一氯二烷比一溴二烷更具硫醇选择性，长期以来一直是定量细胞中谷胱甘肽水平和测量GST活性[27]的首选硫醇反应探针。由于一氯二烷的蓝荧光谷胱甘肽加合物最终积聚在细胞核中，它不是细胞谷胱甘肽[28]核和细胞质分布的可靠指标。

图4。双烷结构及其与硫醇的反应。单溴二烷和单氯二烷分别在3位甲基上有一个Br原子或一个Cl原子，不荧光。该反应基团与低分子量硫醇相互作用形成荧光加合物，激发最大值为394 nm，发射波长为490 nm。

ThiolTracker™Violet (Life Technologies)与完整细胞中的还原硫醇反应，用于流式细胞仪和荧光显微镜的细胞分析。tholtracker™紫罗兰试剂可以穿过活细胞膜，与细胞硫醇反应后变成细胞。其激发波长为404 nm，发射波长为526 nm，适用于DAPI滤波器组成像。据其制造商报道，它的亮度是bimane化合物的10倍。

脂质过氧化是最广泛使用的自由基形成指标之一，是氧化应激的关键指标。不饱和脂肪酸，例如存在于细胞膜中的不饱和脂肪酸，是自由基的共同目标。反应通常发生在链式反应中，自由基从不饱和碳中捕获氢部分形成水。这在脂肪酸上留下了一个未配对的电子，然后能够捕获氧气，形成过氧自由基(图5)。脂质过氧化物不稳定，分解形成一系列复杂的化合物，其中包括活性羰基化合物，如丙二醛(MDA)。

图5。脂质过氧化的图示。

脂质过氧化的测量历来依赖于硫代巴比妥酸(TBA)活性化合物的检测，如脂质过氧化产物[25]分解产生的丙二醛。乐鱼平台入口虽然这种方法存在争议，因为它非常敏感，但不一定针对MDA，它仍然是最广泛使用的测定脂质过氧化的方法。该反应发生在90-100ºC的酸性条件下，产生的加合物可以在532 nm比色法进行测量，也可以使用530 nm激发波长和550 nm发射波长[29]进行荧光测量(图6)。使用吸光度或荧光检测技术，有许多商业检测试剂盒可用于该测定。

图6。MDA-TBA加合物形成。

花生四烯酸的f2样前列腺类衍生物，称为f2 -异前列腺烷(IsoP)的形成已被证明是脂质过氧化的特异性[30]。与TBA试验不同，IsoP的测量似乎是针对脂质过氧化物的，它们是稳定的，不是由任何酶途径产生的，因此更容易解释。

已经为isop开发了许多商业ELISA试剂盒，但样品中的干扰剂需要在运行试验之前对样品进行部分纯化。唯一可靠的检测手段是使用GC/ MS，这使得它昂贵并限制了吞吐量。

使用定位于膜的荧光衍生物可以观察活细胞中的脂质过氧化。例如，BODIPY®581 / 591十一酸荧光团的多不饱和丁二烯基部分的氧化导致荧光发射从590 nm转移到510 nm[32,33](图7)。该试剂作为Image-iT®脂质过氧化试剂盒(Life Technologies)提供了一种简单的比例测定方法，用于检测活细胞[34]中细胞脂质的氧化降解。红色荧光与绿色荧光的比值提供了脂质过氧化的测量，不受脂质密度等因素的影响，这些因素可能会影响单发射探针的测量。由于该试剂与活细胞兼容，测量可以实时进行，无需固定和染色。该试剂还被用于验证血浆[35]和脂质囊泡[36]的抗氧化能力。

图7。C11-BODIPY(581/591)结构。

固定细胞中的脂质过氧化衍生蛋白修饰可以使用亚油酰胺炔烃(LAA)与Click-iT®化学(Life Technologies)联合检测。亚油酸是哺乳动物中含量最多的多不饱和脂肪酸，其脂质过氧化产物可能是脂质衍生蛋白羰基[37]的主要成分。乐鱼平台入口当与活细胞孵育时，LAA与细胞膜结合。脂质过氧化后，膜结合的LAA被氧化并产生9-和13-氢过氧-十八碳二烯酸(HPODE)。这些氢过氧化物分解成α，β-不饱和醛，很容易修饰它们周围的蛋白质。一旦细胞固定，可以通过与Alexa Fluor®488叠氮化物反应来检测所产生的含炔烃的蛋白质(图8)。

图8。Click-iT®LAA的作用机理。

过氧化物

超氧化物检测是基于超氧化物与其他化合物的相互作用来产生可测量的结果。铁细胞色素c还原为铁细胞色素c已在许多情况下用于评估超氧化物形成的速率[38]。(Eq 4)

虽然不完全针对超氧化物，但该反应可以在550nm比色法监测。添加酶抑制剂，如CN-或活性物质的清除剂，如过氧化氢酶，可以最大限度地减少任何再氧化。乌头酶催化柠檬酸盐转化为异柠檬酸盐。超氧化物通过氧化cubane {4Fe-4S}簇中的Fe(II)部分使该酶失活。因此，超氧化物浓度可以通过酶失活的程度来估计。用240 nm的吸光度法将20 mM的异柠檬酸酯转化为cicaconitate，可以监测酶的活性。偶联法中，乌头酶产物异柠檬酸被依赖于NADP+的异柠檬酸脱氢酶转化为α-酮戊二酸也可以使用。在该反应中，NADPH的产生可以在340 nm[21]比色法监测。

化学发光反应已被用于其潜在的增加灵敏度的吸收为基础的检测方法。最广泛使用的化学发光底物是Lucigenin，但这种化合物具有氧化还原循环的倾向，这引起了人们对其用于测定超氧化物产生的定量速率[39]的怀疑。有人建议使用低浓度的这种化合物作为减少这一问题的一种手段。腔肠嗪也被用作化学发光底物。这种亲脂化合物不氧化还原循环，比Lucigenin更亮。但它并不完全针对超氧化物，因为过亚硝酸盐的存在会导致化学发光[40]。

氢菁染料是超氧化物和羟基自由基的荧光传感器。这些染料是用硼氢化钠还原花菁(Cy)染料的亚鎓离子合成的。而弱荧光，氧化后，其荧光强度增加100倍。除了荧光外，氧化还将分子从膜渗透转化为离子不渗透的部分[41]。这些探针中最具特点的是Hydro- Cy3和Hydro- cy5。

超氧化物的细胞生成可以用二氢乙啶来观察，也称为氢乙啶。这种化合物在胞浆中显示蓝色荧光，直到主要被超氧化物氧化，并在较小程度上被其他活性氧或活性氮氧化为止。二氢乙二氧化导致2-位置的羟基化，形成2-羟乙二(图9)。氧化时，化合物嵌入细胞DNA，将细胞核染成明亮的荧光红色，报道的激发波长和发射波长分别为535 nm和635 nm[42]。

图9。超氧化物氧化二氢乙硫生成2-羟乙硫。

使用MitoSOX™Red试剂(Life Technologies)使用荧光显微镜可以看到线粒体特异的超氧化物。MitoSOX™红色试剂是二氢乙二胺的阳离子衍生物，可渗透活细胞，选择性地靶向线粒体。MitoSOX Red指示剂的阳离子三苯膦取代基负责探针在活跃呼吸线粒体中的电泳驱动摄取(图10)。与二氢乙二一样，这种化合物嵌入线粒体DNA，产生红色荧光。虽然可以使用510 nm的峰值激发波长进行荧光测量，并在590 nm处进行发射检测，但有报道称，在~400 nm处，由超氧化物以外的活性氧产生的乙锭氧化产物的激发光谱中不存在较小的激发峰，可以更好地识别超氧化物[42]。

图10．氧化MitoSox™Red线粒体超氧化物指示器的结构。

线粒体活性氧的生成可以通过MitoSOX™染色细胞成像来观察。例如，非甾体抗炎药双氯芬酸通过诱导活性氧[43]与肝毒性有关。使用MitoSOX法确认线粒体氧化应激;在三天内对肝脏显微组织进行双氯芬酸剂量的三对数滴定后，仅在最高剂量(300 μM)中观察到红色荧光探针的信号显著增加，这表明一旦达到阈值，升高的超氧化物水平就不能再中和(图11)。

图11。双氯芬酸给药3天后线粒体氧化应激评估。三维肝脏微组织的重叠图像，用Hoechst 33342(蓝色)和MitoSOX™Red(红色)染色;分别使用DAPI或RFP Cytation 3成像通道捕获。对DAPI染色细胞[44]进行自动聚焦。

CellROX®试剂是Life Technologies公司的一系列专有试剂。这些细胞渗透染料在还原状态下具有弱荧光，并在被活性氧(ROS)氧化时表现出光稳定荧光。CellROX®绿色仅在随后与DNA结合时变成荧光，限制其存在于细胞核或线粒体。该化合物的激发波长为485 nm，发射波长为520 nm，使其适合使用绿色GFP滤波器组成像。该试剂可以甲醛固定，其信号存活洗涤剂处理，使其与其他兼容的染料和抗体复用。CellROX®橙色和CellROX®深红色不需要DNA结合荧光，定位在细胞质中。CellROX®橙色的激发波长为545，发射波长为565，可以用RFP滤波器立方体成像，而CellROX®深红色的激发峰为640 nm，发射峰为665 nm，可以用a成像CY5多维数据集。

过氧化氢

过氧化氢(H₂O₂)是在有丝分裂刺激或细胞周期调节方面最重要的ROS。有许多荧光底物作为氢供体，已与辣根过氧化物酶(HRP)结合使用，以产生强烈的荧光产物[21]。乐鱼平台入口虽然清单相当广泛，更常用的底物包括二乙酰二氯荧光素[45]，高香草酸[46]和Amplex®红[47]。在这些例子中，增加H₂O₂形成越来越多的荧光产物。例如，Amplex Red在HRP存在的情况下被过氧化氢氧化，并在此过程中转化为间苯二酚[47]。与Amplex Red不同，间苯二酚是一种高度显色的化合物，可以在570 nm比色法检测到，也可以通过570 nm激发和585 nm[48]荧光检测到(图12)。

图12．用热过氧化物酶(HRP)将氨plex红转化为间苯二酚₂O₂．

经辣根过氧化物酶催化，过氧化氢氧化homvanilic。同Amplex红一样，同香草酸单体不荧光，但作为调光剂，其峰值激发波长为315 nm，发射波长为425 nm(图13)。使用该化合物评估过氧化氢的产生时应小心。荧光测量的激发和发射波长的近紫外性质使该化合物容易产生不正常的背景信号，特别是当使用聚苯乙烯微板时。除了HRP[49]外，几种过氧化物酶样金属卟啉已被证明对该反应具有催化作用。

图13．HRP和过氧化氢作用下高香草酸的二聚。

一些比色底物，如四甲基联苯胺(TMB)和酚红也已与辣根过氧化物酶一起用于测量过氧化氢浓度。一般来说，比色法的灵敏度低于荧光检测方法，但当使用基于管的或基于微孔板的检测方法时，仪器成本明显低于基于荧光的测量所需的成本。

当使用HRP催化底物来定量过氧化氢时，应该注意一些问题。细胞化合物如硫醇可以作为HRP的底物。内源性过氧化氢酶活性可人为降低H₂O₂礼物。细胞成分可以影响荧光信号取决于激发和发射波长，与同香草二聚体一样，而其他波长可能受到信号猝灭的影响。

Tarpley等人非常简洁地总结了酶标连接测定法的实用性，指出该方法对H的定量非常有用₂O₂培养细胞、器官培养物和分离缓冲灌注组织制剂。但这些方法不适用于H的测定₂O₂在血浆或血清中，因为许多还原剂存在于细胞外液中…"[21]。

将2 ' -7 '二氯荧光素(H2DCF)氧化为2 ' -7 '二氯荧光素(DCF)已广泛用于H₂O₂．二乙酸的形式，H2DCFDA和它的乙酰甲酯H2DCFDA- am被细胞吸收，非特异性的细胞酯酶作用于它，分裂亲脂基团，导致一种带电化合物被困在细胞内。H2DCF被ROS氧化后转化为2 '，7 '二氯二氢荧光素(DCF)，具有很强的荧光性(图14)。报道的DCF荧光测量波长为激发498 nm和发射522 nm。

图14。ROS生成荧光化合物DCF。

最初，DCF被认为是过氧化氢特有的，但最近的证据表明，其他ROS如硝酸盐和次氯酸也能氧化H2DCF[66]。最重要的是H₂O₂H2DCF的依赖氧化需要亚铁[50]。此外，由于H2DCF不再是离子，它不排除迁移出细胞并积聚在介质中，在那里它可以自由地与氧化剂相互作用。除了基于PMT的荧光测量，氧化DCF荧光可以使用FITC或GFP滤波器组成像。例如，抑制DNA拓扑异构酶I的细胞毒性喹啉生物碱喜树碱对培养的原代肝细胞[51]造成氧化应激。如图15所示，微摩尔浓度的喜树碱通常会在视野范围内约10-20%的细胞中诱导产生ROS。

图15。肝细胞氧化DCF荧光。800 nM喜树碱处理0和30分钟后捕获的培养肝细胞图像。细胞核用Hoechst 33342染色(蓝色)，线粒体用MitoTracker®Red染色(红色);氧化后的DCF试剂以绿色显示[68]。使用20x物镜使用Cytation™3成像多模式微板读取器(BioTek Instruments)捕获图像。

为了解决DCF荧光的缺点，研制了几种新型荧光探针。两个这样的探针是过氧化物绿1 (PG1)和过氧化物深红1 (PC1)。这些硼基H₂O₂据报道，探针具有高选择性，膜渗透性，以及可见光波长的激发和发射波长[50]。与过氧化氢反应，PG1和PC1的荧光分别增加了10倍和40倍。PG1的激发波长为460 nm，最大发射波长为510 nm(图16)。PC1表现出改进的红移激发特性和更大的斯托克斯位移，从而减少了自荧光(激发:480 nm;发射:584 nm)[52]。

图16。过氧绿1和过氧深红1的结构。

这些分子与过氧化氢有直接反应，与H没有直接反应₂贴现。此外，这些分子对源自血红素蛋白和H₂O₂．DCFH通常对这种组合表现出比对H更大的反应₂O₂．

钙黄素-乙酰氧基甲基酯(钙黄素- am)也被报道为细胞内氧化活性的检测器[53]。钙黄素am是一种可穿透荧光细胞的化合物，由细胞内酯酶转化为细胞不渗透阴离子钙黄素，具有荧光性(图17)。历史上，细胞内钙钙素的产生已用于显微镜和荧光计作为活细胞的指标。在活性氧的检测方面，活性氧反应的动力学相对于酯转化为钙黄素有利。

通过薄层色谱[53]，钙黄素AM的ros氧化产物在化学上与钙黄素AM不同，但它仍然保留了穿越细胞膜的能力，并具有与荧光钙黄素相似的光谱特性。因此，重要的是将化合物保持在培养基中，而不是在细胞加载后将其冲洗掉，这通常是在使用化合物进行细胞存活时执行的。除去染料的结果是反应的化合物按浓度梯度从细胞中移出。钙黄素AM的物理性质也不同于钙黄素AM或钙黄素，因为染料倾向于聚集并在细胞内形成强烈的荧光定位。虽然这种染料在共聚焦显微镜下有可能进行细胞定位，但无法在光谱上区分ROS反应的钙黄素am和酯酶反应的产物，这使得在微板中使用这种染料存在问题。

图17．Calcein-AM结构。

一氧化氮

自由基一氧化氮(•NO)由许多不同类型的细胞产生，具有不同的生物学功能。一氧化氮是l -精氨酸氧化为l -瓜氨酸的产物，由酶一氧化氮合酶(NOS)催化的两步过程。一氧化氮合酶的两种主要异构体已经被鉴定出来。在神经元和内皮细胞中发现的本构异构体，以钙和钙调素依赖的方式产生极少量的一氧化氮。•NO激活靶细胞内可溶性guanlyate cyclase，导致cGMP水平升高，进而促进神经元传递和血管舒张，抑制血小板聚集[54]。

在巨噬细胞、成纤维细胞和肝细胞中发现的诱导亚型，在炎症或有丝分裂刺激下产生相对大量的•NO，并通过其氧化毒性[55]在宿主中起防御作用。无论其来源或作用如何，自由基•NO的半衰期都很短(t½= 4秒)，它与几种通常存在的不同分子反应形成硝酸盐(NO_3.-)或亚硝酸盐(NO₂-）

间接测定•NO的常用方法是比色法测定其组成产物硝酸盐和亚硝酸盐。乐鱼平台入口这个反应需要硝酸盐(NO_3.)首先还原为亚硝酸盐(NO₂)，通常由硝酸还原酶的作用(图18)。

图18。通过硝酸还原酶的作用将硝酸盐转化为亚硝酸盐。

随后通过两步过程测定亚硝酸盐(图19)提供了关于硝酸盐和亚硝酸盐“总量”的信息。在氢离子的存在下，亚硝酸盐生成亚硝酸盐，亚硝酸盐与磺胺反应生成重氮离子。然后与N-(1-萘基)乙二胺耦合形成发色团，吸收波长为543 nm[56]。

亚硝酸盐只能在平行测定中进行，在比色测定之前样品未被还原。实际的硝酸盐含量是用总硝酸盐含量减去亚硝酸盐含量来计算的。这种方法相对便宜且容易进行。试剂很容易获得，有许多商业试剂盒可用于该检测。

图19所示。用Greiss反应测定硝酸盐。

为了提高Griess试剂测定•NO的灵敏度，已经开发了一些荧光测定方法。像Griess反应一样，它们依赖于三氧化二氮或亚硝酸盐(N₂O_3.)，由亚硝酸盐(NO₂-)。最常用的方法是使用相对不荧光的2,3 -二氨基萘(DAN)与亚硝酸反应生成2,3萘三唑(NAT)，其激发波长为375 nm，发射波长为415 nm，具有高荧光性(图20)。

图20．用2,3 -二氨基萘荧光法检测亚硝酸盐。

基因编码传感器

基于荧光蛋白的生物传感器已被开发用于实时原位研究ROS。这种新一代活细胞荧光传感器产生荧光变化，以响应氧化还原状态的改变或特定目标分析物的波动。这些传感器是基于单个荧光蛋白进行基因编码的，不需要添加任何其他试剂或细胞裂解，这使得它们非常适合多路复用。

还原氧化敏感绿色荧光蛋白(roGFP)是氧化还原敏感生物传感器的一个例子。将2个半胱氨酸引入到β桶结构表面暴露残基的适当位置，形成victoria Aequorea GFP蛋白的二硫键。工程硫醇的氧化状态决定了传感器[57]的荧光特性。最初，研究人员提出了不同的roGFP版本，以实现植物[58]中的细胞质(roGFP2)等还原性区室的体内成像，发现在氨基酸147和204位引入半胱氨酸会产生最大的变化[59]。通过将其与人谷胱甘肽1 (Grx1)[60]连接，roGFP2对谷胱甘肽的特异性进一步增强。谷胱甘肽是一种被底物氧化并被谷胱甘肽非酶还原的小酶。通过在感兴趣的生物体中表达Grx1-roGFP融合传感器和/或将蛋白质靶向到细胞隔室，可以实时测量特定细胞隔室中的谷胱甘肽氧化还原电位，这比侵入性静态方法具有显著优势。注意，该探针不直接测量ROS化合物。然而，它确实检测到氧化/还原(GSH/GSSG)谷胱甘肽平衡的变化。在检测方面，rogfp在约400和490 nm处有两个荧光激发极大值，具有共同的515发射，在体外和体内，随着氧化还原电位的改变，荧光显示出快速和可逆的比例变化。 Disulfide formation results in the protonation of GFP with increases 405 excitation signals at the expense of 488 nm excitation signals when the emission output at 510 nm is determined. Thus the ratio of fluorescence from excitation at 405 and 488 nm indicate the extent of oxidation. Because this measurement is ratiometric, variations in biosensor levels or matrix induced optical sensitivity is corrected for.

图21。比例氧化还原敏感gfp原理。rogfp的两个激发极值的相对荧光强度随氧化还原状态而变化:还原导致400 nm处激发减弱，480 nm处激发增强(箭头)。从[61]。

为了直接感知H₂O₂roGFP结构与过氧化物酶Orp1有关，Orp1是一种酵母蛋白，与H反应后形成二硫化物₂O₂，通过硫醇-二硫化物交换机制转移到roGFP[62]。通过细胞硫氧还蛋白(Trx)或GRx/GSH系统的作用，该反应是可逆的。这些探针也可作为名为Premo™(Life Technologies)的BacMam 2.0结构，便于转染。

另一种感知H的方法₂O₂直接是将环状排列的荧光蛋白与氧化还原反应蛋白结构域结合，使氧化还原活性所带来的构象变化转化为荧光蛋白。谢尔盖·a·卢基扬诺夫(Sergey A. Lukyanov)[63]的实验室就设计了这样一种嵌合体，称为HyPer。HyPer由环状排列的黄色荧光蛋白(cpYFP)插入到原核生物H的调控域₂O₂-感应蛋白，OxyR[64,65]。HyPer2探针是由野生型OxyR中对应于A233V的HyPer单点突变A406V产生的改进版本[64]。与roGFP-Orp1嵌合体不同，它不存在硫醇-二硫化物转移，而是两个半胱氨酸形成可逆的二硫化物键，诱导构象变化转移到cpYFP部分[65]。HyPer对过氧化氢表现出亚微摩尔亲和力，并已被证明对其他氧化剂不敏感，如超氧化物、氧化谷胱甘肽、一氧化氮和过氧酸盐。

通过利用细胞运输序列作为嵌合分子的一部分，基因编码传感器可以靶向特定的细胞区室。例如，肽可以通过插入重复的核定位信号(NLS)来定位到细胞核，NLS由暴露在蛋白质表面的带正电的赖氨酸和精氨酸的短序列组成。这些序列被细胞蛋白(进口蛋白α和进口蛋白β)识别，它们介导其转运到核酸酶中。类似的序列可用于将ROS传感器定向到线粒体、过氧化物酶体或细胞质。

讨论

对活性氧的兴趣最初围绕着与有氧呼吸的有害影响相关的病理:由线粒体中电子传递链泄漏引起的必要的邪恶。在这种情况下，研究涉及这些因素在衰老、慢性疾病和癌症中所起的作用。

随着发现吞噬细胞的“氧化爆发”实际上是有意产生活性氧的结果，一个新的前沿领域诞生了。这被认为是一种非常特殊的应用，特定的细胞产生只能被称为有毒物质的物质，以杀死入侵的微生物。最近的进一步研究表明，ROS在所有类型的细胞中都能产生，并作为细胞内和细胞间通信的重要细胞信使。现在很明显，细胞内存在一个涉及ROS的非常复杂的细胞内调节系统。细胞对ROS部分的反应取决于信号的强度、持续时间和背景。在细胞内信号方面，过氧化氢(H₂O₂)是最有意思的候选者，而一氧化氮(NO)主要与细胞间信号传导有关。

最初用于ROS检测的化学方法主要是基于吸光度测量。研究通常涉及谷胱甘肽水平的测量，以评估组织或全身水平的氧化应激。以分析物的毫摩尔吸光度为基础的测量超出了足够的信息量和定量。随着ROS被用作细胞内信使和调节剂的发现，考虑到微摩尔检测要求，开发了新的化学试剂。这些试剂主要是基于荧光的，但最近已经引入了基于发光的检测。

使用小分子荧光传感器或基因编码传感器的基于图像的分析的出现为ROS研究提供了新的见解。图像分析不仅可以提供定量信息，还可以提供细胞定位。这可以通过报告器设计或图像分析来实现。化学ROS报告器或基因编码ROS传感器分别被设计为具有化学结构或肽序列，从而导致探测器定位于特定的细胞器(例如细胞核、线粒体、溶酶体等)。因此，图像的任何变化都可以直接与特定的细胞位置相关联。或者，用不具有细胞器特异性的报告细胞对ROS变化进行定位，也可以用具有位置特异性的非ROS相关染色进行共定位。通过叠加单独的彩色图像，可以识别细胞位置。

许多细胞ROS研究报告的最大困难是缺乏针对离散分子的特异性报告剂。ROS部分本质上与许多不同的分子反应;因此，设计报告代理一直是一个难题。随着更具体的化学，特别是过氧化氢，具体的调节机制将被阐明。

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