三维细胞培养:当前技术综述

作者: Brad Larson，高级应用科学家，应用部门，BioTek仪器公司，维诺斯基，VT

简介

在过去的十年中，药物发现工作的中心焦点一直是将在体外更好地模拟目标患者体内条件的测试模型。最初的一步是从使用纯化药物靶点的生化分析转向基于细胞的方法，该方法利用常见宿主细胞系(如CHO和HEK-293)的药物靶点过表达。为了寻求更大的生理相关性，开始使用原代细胞，如果供应充足，最好是人类细胞，并且依赖于药物靶点的内源性表达，检测技术应该足够敏感。这些细胞类型中有很大比例是自然粘附的，允许简单的培养工作流程，即在涂层微孔板中播种细胞，在执行规定的测定之前，培养微孔板以鼓励细胞附着在二维(2D)单层中。虽然在生化和永生细胞系上提供了初步的改进，但大量的证据现在支持这样一个现实，即以这种2D方式培养细胞通常是有问题的，并且是一种相对较差的体内条件和行为模型。使用2D模型，癌症候选药物的损耗率约为95%¹，源于在体外药物疗效价值没有转化为临床，以及不可预见的毒性问题。仅在2011年，在临床试验或接受联邦药物管理局审查的大约900种抗癌疗法中²在美国，只有12个国家获得批准^3.；导致了花费在临床前和临床试验上的数亿美元的损失。这些缺陷的原因可以追溯到使用传统的2D条件，其中细胞外基质(ECM)成分，细胞与细胞和细胞与基质的相互作用，对体内分化，增殖和细胞功能很重要，丢失了⁴．

图1所示。肿瘤微环境⁵．

并行研究还表明，传统的2D细胞培养方法可能无法准确模拟癌细胞所在的3D体内环境(图1)，因为2D环境不允许缺氧区域、异质细胞群(包括基质细胞)、不同的细胞增殖区(静止与复制)、ECM影响、可溶性信号梯度以及不同的营养物质和代谢废物运输⁶(图2)。因此，非自然的2D环境可能提供关于癌细胞对化疗的预测反应的不准确数据⁷．

图2。中心坏死肿瘤中三个微环境区域的示意图。自发性肿瘤可由许多坏死灶组成。各生理参数的递减幅度分别为+++、++、+、+/-、-⁶．

更多的研究表明，个别药物靶点可能没有表达，或者细胞信号的水平可能不等同于体内发现的水平，从而影响实验结果。事实上，一项研究表明，在黑色素瘤细胞中，使用肿瘤样模型，与相同细胞的二维单层细胞培养的基线表达相比，106个基因上调，73个基因下调⁸．有趣的是，在3D模型中被发现上调的基因在肿瘤中也被发现上调。

使用2D细胞培养来创建准确的肿瘤模型的许多相同问题也扩展到肝毒性研究。虽然异种生物毒性测试的金标准涉及体内动物研究，但越来越多的动物福利问题，以及在异质人群中观察到的动物研究结果与疾病表型的一致性较差，使得纳入一种可行的、可预测的方法在体外测试方法优先^9、10．虽然永生化肝源细胞系简化了程序，并消除了对全动物试验的需要，但涉及I期和II期代谢的基因表达谱与在肝组织中观察到的不太相关¹¹．原代肝细胞培养提供的功能水平更接近于在体内看到的，但这些细胞在体外使用时存在问题。在传统的2D培养条件下，细胞去分化，细胞色素P450酶的表达迅速下降，最终失去活力¹²．

大量的研究强调了2D细胞培养的局限性，无论是体内肿瘤还是肝脏模型，都强调了研究方法中对新细胞模型的需求。这一需求可以通过采用3D细胞模型来满足，因为3D培养的细胞表现出更接近复杂的体内条件的特征¹³．与2D培养模型相比，结合3D培养细胞用于评估候选药物的优势包括:(1)氧气和营养梯度，(2)细胞与细胞之间和细胞与ecm相互作用的增加，(3)3D结构内细胞对测试分子的不均匀暴露，(4)不同的细胞增殖区，以及(5)肿瘤微环境中特定部位基质细胞的影响⁵．研究表明，特定细胞系的肿瘤细胞在3D格式下评估时，对抗癌药物的敏感性低于在2D格式下培养时的敏感性¹⁴．然而，其他研究表明，不同的细胞系，使用不同的3D技术，显示出相反的效果¹⁵．这些发现强调了在癌症研究中使用3D细胞培养可能为体内药物活性提供关键见解，如果仅限于2D细胞培养模型，可能会被忽视。此外，可以阐明产生这些差异的机制，例如信号通路的变化，或与使用2D方法培养的细胞相比，3D系统中对目标依赖的转变。

当细胞在基底膜样凝胶中生长时，信号通路相互整合16。与单层球体相比，A549 3D球体表现出持续高水平的IL-6和IL-8分泌。使用3D培养系统增强细胞外基质沉积以获得更好的生物标志物表达¹⁷．利用透明质酸(HA)三维模型分析了间充质基质细胞向软骨细胞的分化。结果表明，细胞受体能更好地与HA相互作用并影响细胞分化。各种因素，包括生物功能微环境、材料化学、细胞相互作用和机械性能增强软骨形成¹⁸．

在肝毒性研究中纳入3D细胞培养时，也观察到与3D肿瘤模型相似的结果。Wu等人观察到3D培养的大鼠肝细胞与单层培养相比保持了更分化的状态¹⁹．在五天的潜伏期内，与使用3D模型的持续高水平相比，使用传统的二维单层小鼠肝细胞培养的CYP1A2和-1A1表达迅速下降^20.．Kratschmar等人进行了长期评估，使用2D三明治培养或3D共培养方法对大鼠肝细胞进行了25天的评估。使用3D培养方法可以看到Nrf2-以及糖皮质激素依赖基因的高表达，而2D肝细胞表现出快速下降，随后两组基因的持续低表达²¹．

三维细胞培养模型

目前有各种各样的技术可以将细胞培养成3D结构。这些可以分为两大类;基于脚手架和非脚手架的，包括以下单独的技术:

脚手架的基础

• 高分子硬支架
• 生物支架
• 微图案化表面微板

Non-Scaffold基础

• 悬滴微板
• 含有超低附着(ULA)涂层的球形微板
• 微流体3D细胞培养

基于支架的3D细胞培养

高分子硬支架

3D肿瘤和组织模型可以通过在预制支架或基质上培养细胞来创建，这些支架或基质旨在模拟体内ECM。细胞附着，迁移，并填满支架内的间隙形成3D培养²²．该支架被用作物理支撑系统在体外细胞培养，也显示出在体内组织再生的前景，因为它们有可能重建活组织的自然物理和结构环境²³．多种几何构型的常见聚合物，包括聚苯乙烯(PS)和聚己内酯(PCL)，存在。如图3所示，包括多孔盘(3A)、静电纺(3B)和正交分层(3C)。

图3。(A)多孔圆盘(图片由James Weaver和Mooney实验室，HSEAS和Wyss研究所提供);(B) Electrospinning(图片由The Electrospinning Company, Ltd提供);(C)聚合物3D支架的正交分层(图像由3D Biotek, LLC提供)几何构型。

聚合物硬支架被纳入两个不同的研究领域;再生医学和临床前研究在体外测试。在前者中，细胞在支架上生长，最终在体内移植以取代退化或改变的组织。目前，支架被用于工程骨、软骨、韧带、皮肤、血管、神经和骨骼肌组织²⁴．Ge等人特别开发了一种3D打印方法，使用丙交酯和乙二醇共聚物，支持成骨细胞的增殖和成骨分化²⁵．骨组织再生效果的评估表明，在支架内，新的骨组织形成和成熟的时间超过24周。

为临床前在体外在测试中，细胞在支架上生长的唯一目的是在实验室环境中模拟肿瘤或组织。一旦支架形成，它们被切割成适合适当的测试容器的直径;通常是培养皿或微孔板(图4)。最终支架的典型厚度为150-200 μm;每个都含有一致的孔隙大小。

图4。用于插入测试容器的正交分层聚合物3D支架的制备(图片由NIST提供)。

一旦支架插入(图5)，细胞处理和测定成分分配程序随后以类似于2D细胞培养的方式进行。纤维和气孔的排列使细胞保持接近营养来源，使营养物质、废物和气体的交换类似于在体内看到的。利用这一知识，Bergenstock等人证明了MCF-7和HepG2癌细胞系，使用PS支架在3D和传统的2D格式中培养，表现出更高水平的增殖和代谢活性，这一点由更高的a₅₇₀在长达两周的潜伏期内的吸光度值。抗癌药物他莫昔芬和甲氨蝶呤治疗的细胞毒性作用也在同一时间段内从3D培养的细胞中观察到²⁶．

图5。微微板格式的聚合物3D支架的最终接头配置(图片由Electrospinning Company, Ltd提供)

生物支架

支架也可以由更自然或生物来源的成分制成，如体内ECM中常见的蛋白质。这些通常包括但不限于纤维连接蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白和明胶。生物支架不仅提供了细胞可以附着并重组成3D结构的基质，更重要的是，它们提供了细胞在体内环境中与可溶性生长因子、激素和其他分子相互作用的正确微环境，这些分子可以改变基因和蛋白质的表达²⁷．目前的方法要求细胞在微孔板中电镀之前以液态(水凝胶)与支架蛋白混合(图6A)，或者添加到先前形成的支架上，或者将蛋白质混合物覆盖在已经聚集成3D球体的细胞上。然后细胞可以重组周围的环境，释放信号分子，允许迁移，或适应其他细胞功能(图6B)。最终的结果是创造一个适当的内稳态。

图6。(A)分配到微孔板后，胶原纤维悬浮在介质中的表示。(图片由龙沙公司提供);(B) HT-1080细胞侵入三维胶原蛋白基质²⁸．

由于这些水凝胶来自天然来源，它们促进许多细胞功能，导致增加活力和多种细胞类型的增殖。它们也可以优于聚合物支架，因为后者缺乏促进适当细胞行为的内源性因子，主要作用于允许细胞功能²⁹．

水凝胶还提供了使用多层格式来形成组织状结构的警告。单个细胞类型被嵌入到单独的水凝胶悬浮液中，并相互分层。然后，细胞在水凝胶中组织，形成体内组织中的层。可渗透支架也可用于模拟不同的气液界面在体外的方式。例如，类似于人类皮肤真皮层和表皮的双分子层^30.和人类角膜缘隐窝³¹．

微图案化表面微板

微图案表面板利用了微加工技术的最新进展。每个板包含微米大小的隔间，在每个孔的底部有规律地排列。井的形状可以是各种各样的，包括方形、圆形或相邻井之间有裂缝的方形(图7A-C)。根据所使用的单元类型，对球体或单元网络形成的不同配置进行了优化。

图7．微图纹微板包含(a)圆形，(B)方形，或(C)狭缝图案在板孔内(图片由Kuraray Co.， Ltd提供)

涂层孔在每个微空间内创建低粘附表面。通过这种方式，添加到孔中的细胞最初附着在微空间的底部，然后在随后几天的培养中聚集在一起形成球形结构。或者在狭缝模式的情况下，沿阱底形成连续的细胞网络(图8)。

图8．含有细胞网络的裂隙型微图纹微板(图片由Kuraray Co.， Ltd提供)

平板的底部由一层薄而透明的薄膜制成，适合用于细胞结构的显微成像。最近的研究证实，与传统的2D格式培养相比，使用微图板培养的细胞表现出不同的酶表达水平和药物反应性。Kobayashi等人证明，与传统2D格式培养的相同细胞相比，在微图板上培养的肝细胞癌细胞系FLC-4表现出更高的药物代谢酶表达水平，包括CYP3A4、CYP2C9和UGT1A1³²．结果与培养成球形的大鼠原代肝细胞一致，证实了形态变化和细胞间相互作用是酶表达增加的原因³³．

基于非支架的3D细胞培养

悬滴微板

悬挂式滴板(HDP)利用了这样一个事实，即细胞在没有附着表面的情况下，会自我组装成一个三维球体结构。每个板都符合SBS标准，但HDP井底包含一个开口，而不是包含传统的井底。HDP孔的顶部类似于传统的微孔板，其中可以分配介质中的细胞(图9A)，而底部开口的孔径经过精心设计，可以形成足以用于细胞聚集的离散介质液滴，但也足够小，表面张力可以防止液滴在操作过程中被移出(图9B)。悬浮介质中的细胞在数小时到数天的过程中聚集，形成最终的球形结构。

图9。HDP顶部和底部开口的可视化(图片由3D Biomatrix提供)。

球体的大小是由分配到每滴细胞的数量来控制的。共同培养的球状体也可以通过在初始分配时添加多种细胞类型或按顺序添加，使每组细胞聚集成单独的层来创建。

对于球体的长期培养，并进行分析，球体通常从悬挂滴板转移到另一个能够容纳更大介质或缓冲体积的板上(图10)。更大的体积确保了聚集的细胞处于合适的条件下，如营养水平和pH值，繁殖期可达几天甚至几周。

图10。悬滴球形聚集板和二次检测/传播板。(图片由3D Biomatrix提供)。

由于三维细胞结构的圆形配置，球体非常适合用作基于细胞的组织模型和肿瘤模型，其中包括永生化癌细胞系。Kermanizadeh等人所做的工作证实了这一点，他们使用三维人类肝脏显微组织模型来检查纳米材料潜在的慢性肝毒性作用34。卵巢癌球体，使用384孔悬挂滴平台创建，也被Raghavan等人用于临床前药物敏感性分析³⁵．使用悬滴法形成的球体也可以嵌入生物支架中，以模拟癌性肿瘤周围的ECM。该组合允许在体内检查肿瘤转移使用an在体外三维模型³⁶．

含有超低附着(ULA)涂层的球形微板

球形微板也可以用于创建相同的圆形多细胞组织或肿瘤模型。板具有SBS 96或384孔微孔板的典型孔形和深度。由于井内介质和试剂体积容量较大，可在同一平板内进行球形聚集、传播和实验程序;不需要转移到第二个微孔板。

图11。(A)透明(图片由PerkinElmer, Inc.提供)和(B) 96井和384井配置中的黑色壁，透明底部ULA球形微板(图片由康宁公司提供)

添加到井底的ULA表面涂层可以最大限度地减少细胞粘附，从而形成球体。井底也具有圆形、锥形(图12)或v形几何形状，既能确保形成一致的单一球体，也有助于将球体置于井中央。

图12。ULA球形微板具有(A)圆形(图片由康宁公司提供)和(B)锥形井底配置(图片由InSphero提供)。

基于ULA球形微板的细胞聚集和检测性能也纳入了当前的研究方法。Ivanov等人演示了如何将神经干细胞添加到ULA球形微板中。然后聚集形成3D神经球，用于监测生长动力学和药物毒性。Vinci等人也进行了类似的工作，他们在球形微板中测试了各种永生化细胞系，以制造肿瘤球形或类肿瘤³⁸．在暴露于细胞毒性剂后的繁殖和细胞活力再次在多日潜伏期进行检查。然后将测试扩展到将ECM添加到先前形成的球体上，这样球体就完全嵌入在基质中。实验随后证实，使用这种配置，3D肿瘤侵袭分析可以用球形微板进行。

微流体3D细胞培养

如前所述，3D细胞培养技术致力于重建体内组织和肿瘤的三维结构，以及细胞与ECM之间的相互作用。微流控平台也可用于创建类似的异构模型，同时通过向细胞环境引入渗透流方面来增加额外的复杂性;允许持续的营养和氧气的引入，以及通过培养基清除废物。细胞通过不同的物理或非物理屏障维持在一个隔间内。然后将含有营养物质、化学物质、处理分子或染色试剂的培养基灌注过细胞(图13)。障碍物中的预定义间隙允许隔间之间的交互。

图13。微流体三维培养系统中的灌注表示。细胞由微柱维持在预定义的隔间中，允许与灌注介质相互作用(图片由EMD Millipore公司提供)。

集成到微流控装置中的物理屏障传统上由玻璃或硅、聚合物(包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)和聚苯乙烯(PS))以及色谱或滤纸组成³⁹．细胞还可以与支撑基质(如胶原蛋白或Matrigel®)结合，以促进细胞- ecm相互作用并促进组装成3D结构。ECM的引入还允许创建不包含物理屏障的微流体设备。基质聚合使细胞保持在预定的培养区域内，并在灌注过程中起到过滤器的作用⁴⁰．

微流体系统也用于各种3D细胞培养应用，包括干细胞、原代细胞和癌细胞。Yu等开发了三维微流体细胞培养系统，并将该系统应用于大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分化研究。在体外⁴¹．Wan等人还开发了PDMS装置来研究小鼠胚胎干细胞向心肌细胞的分化⁴²．最后，Liu等人利用微流体装置在三维基质中研究了癌相关成纤维细胞对癌细胞侵袭的影响⁴³．

结论

当试图决定哪种3D细胞培养技术最适合特定应用时，可用的3D细胞培养技术列表可能令人生畏。虽然所有的方法都努力在类似活体的细胞环境中创造，但某些技术更适合于重新创造在体外屏障模型(即皮肤和肺)。其他的则更适合模拟癌性肿瘤或组织。传统的用于2D培养细胞的分析方法也可能需要重新优化，因为需要组分穿透直径数百微米的基质和3D细胞结构。未标记细胞成像作为一种分析技术也应被考虑，因为不是所有的基质都是透明的，或者平板/设备设计可能限制准确的细胞可视化。记住这些条件，正确的3D细胞培养技术可以满足预期的研究目标。

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