2020年3月13日,
简介
量子比特dsDNA BR法目前在大量实验室中用于DNA定量;然而,该套件是为低通量,微离心管格式设计的。因此,寻求提高吞吐量的实验室正在调整试剂的使用96孔微板分析格式。本技术说明描述了建立标准曲线所需的材料、方法和Gen5参数,并使用96孔板格式的量子位dsDNA BR分析试剂进行DNA定量协同Neo2多模的读者。精确模拟量子位试剂范围(0.1 - 1000 ng/μL)所需的最小标准数被确定为四个:0.1、1、10和1000 ng/μL。
材料:
- 量子比特®dsDNA BR检测试剂盒(分子探针目录# Q32850)
- 在TE缓冲液中纯化鲱鱼精子DNA (Sigma-Aldrich, Catalog # D6898)
- TE缓冲液(10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0)。
- 纯黑色,96孔微板(康宁,编号3915)
- 单通道和8通道移液器10-200 μL范围
试验设置:
- 将量子位溴化试剂(200X) 1:200稀释在量子位dsDNA溴化缓冲液中制备量子位工作液。
- 从2.2 mg/mL的TE缓冲液鲱鱼精子DNA原液中制备了4、5、6和8点连续对数稀释系列标准物,稀释范围在1000 ng/μL到0.1 ng/μL之间。这是量子位dsDNA检测试剂盒的声明验证范围。
- 每种标准的实际浓度在Synergy Neo2中通过A260在96孔板中读取并进行路径长度校正验证。
- 用多通道移液器向96孔板中加入10 μL的DNA标准品,然后加入190 μL的量子位工作溶液(最终体积为200 μL),在RT下孵育5分钟,然后在Synergy Neo2上读取。
协同Neo2设置:
- 本试验使用康宁#3915黑色底部96孔微板,但可以选择默认的“96孔板”作为板型。
- 荧光强度测量使用单顶PMT与GFP滤立方(部分# 1035108;EX 485/20 nm EM 530/25, DM 510)。
推荐的协议设置:
过程
- 从板类型下拉菜单中选择96孔板
- 阅读方法:
- 检测方法:荧光强度
- 阅读类型:端点/动能
- 光学类型:过滤器
- 阅读步骤:荧光强度
- 步骤标签:dsDNA Std Crv
- PMT:单
- 滤波器组1:485/528
- 光学位置:前
- 收获:50
板布局
数据简化
结果
综合数据在Gen5™中绘制标准曲线,标准数量不同,分别为4个和8个。该图显示了标准曲线之间良好的相关性,使用4参数非线性回归分析进行拟合,产生的标准浓度只有4个;0.1、1.0、10和1000 ng/μL dsDNA。
结论
荧光试剂的使用可以提高核酸定量的特异性和敏感性。使用Qubit dsDNA BR试剂与Synergy™Neo2多模式阅读器结合使用,可以在96孔微板格式中使用4(4)个DNA标准进行dsDNA定量。用4种标准标准制作的曲线拟合与用多达8种标准标准制作的曲线拟合相当,可以显著节省试剂。
TN031020_01