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改进厚标本共聚焦成像的光学清除

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2021年3月23日

简介

近70年前发展起来的共聚焦显微镜已经成为荧光标记生物样品成像的支柱。宽视场显微镜用漫射光场照亮生物样品,激发感兴趣的焦平面上下的荧光团,从而产生模糊的、分辨率较低的图像。通过在样品和光探测器(相机或PMT)之间的偶联焦平面上放置一个针孔,共聚焦显微镜块污染了失焦光,从而提高了轴向(z)分辨率(图1)。这种改进的分辨率意味着可以在厚样品(如椭球体和切除的组织)中更深入地拍摄更细的z切片,并且可以更好地阐明三维生物关系。

粘附HT-1080球体。

图1所示。粘附HT-1080球体。粘附的1000细胞HT-1080球体固定,用Hoechst 33342和Alexa Fluor 488-phalloidin染色,然后保留缓冲液(PBS),或交换ScaleS4清洗剂或80%甘油。然后以宽视场或共聚焦(60 μm圆盘)模式在20x (0.45NA)下捕获z -堆栈。然后生成整个z层的最大强度投影。


较差的图像质量和分辨率(例如信噪比)不仅可能是由兴奋的失焦荧光团造成的,还可能是由诸如脂质和蛋白质等生物物质造成的。在后一种情况下,聚焦光在穿过样品时发生衍射,减少了被检测到的信号量。衍射效应是通过折射率来量化的,折射率是光速通过材料时受到影响的一种测量方法。匹配安装介质和样品的折射率与显微镜光学尽可能接近将有助于最大限度地减少衍射光,这反过来将提高图像的质量。

较差的图像质量和分辨率(例如信噪比)不仅可能是由兴奋的失焦荧光团造成的,还可能是由诸如脂质和蛋白质等生物物质造成的。在后一种情况下,聚焦光在穿过样品时发生衍射,减少了被检测到的信号量。衍射效应是通过折射率来量化的,折射率是光速通过材料时受到影响的一种测量方法。匹配安装介质和样品的折射率与显微镜光学尽可能接近将有助于最大限度地减少衍射光,这反过来将提高图像的质量。

HT-1080球面体在不同成像介质中的成像深度极限

图2.HT-1080球面体在不同成像介质中的成像深度极限。在图1中,当核对PBS(上面板)或ScaleS4或80%甘油(下面板)无法分解时,从每个粘附的球体中选择z型切片。


HT1080球体成像样品制备

HT-1080球状体通过将1000个细胞植入康宁公司(Corning, NY)的超低附着(ULA) u型底部96孔板#4520中形成,并在Thermo Fisher Scientific公司(Waltham, MA)的Advanced DMEM (Gibco)中在37°C下合并24小时。然后将球体转移到安捷伦技术公司(Santa Clara, CA)的透明、平底96孔板#204626上(1个球体/孔),并在RT下沉淀并建立粘附1小时。然后将含有球体的盘子转移回37°C的培养箱,并允许附着在培养区并传播一夜。带迁移细胞区域的附着球体用4%的PFA固定30分钟,然后用0.5%的PFA渗透1小时。为了实现染料的完全渗透,球体用Hoechst 34580和Alexa Fluor 488-phalloidin在4°C下染色过夜。然后洗净球状体,PBS保持不变或换成自制的安装介质(80%甘油,20 mM三磷酸,pH 8.0, 0.5%没食子酸正丙酯,0.05% NaN3)或ScaleS4 (40% d -山梨醇,10%甘油,4M尿素,15% DMSO, 0.5%没食子酸正丙酯,0.05% NaN3)(图1)。

成像程序与处理

在手动模式(IMM)下,使用Cytation C10共焦成像阅读器和Gen5软件在40倍下捕获所附HT-1080球体的共焦和宽视场z-stack图像。通过选择“显示饱和像素”按钮,使每个通道的动态范围最大化。每个通道的曝光设置都经过调整,使它们处于范围内,并且没有饱和像素。z范围是通过在样本的下面和上面切换来确定的,直到感兴趣的结构(在这个例子中,一个球体)在强度上消失。z步长使用Nyquist抽样建议设置;对于使用40x空气物镜(NA = 0.6)成像Alexa Fluor 488,确定宽视场步长为1 μm,共聚焦步长为0.6 μm。然后使用基于目标的点扩散函数对图像进行5次反褶积迭代。然后对反卷积图像进行预处理以减少背景信号。Hoechst 34580 (DAPI通道)和Alexa Fluor 488-phalloidin背景还原的滚动球尺寸分别为25和50 μm。比较所有三种条件(PBS, 80%甘油,ScaleS4)的等效z高度,以确定成像深度极限(图2)。

结论

共聚焦显微镜是一种强大的成像模式,通过去除失焦光来提高图像质量,然而样品固有的衍射荧光光源阻止了这种改进真正实现。使用清除剂可以匹配样品的折射率,在本例中是HT-1080球体,光学系统的折射率可以提高成像深度和分辨率。


仅供研究使用。不用于诊断程序。

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