2017年9月5日
简介
测量汇流是一种直接和直接的方法来量化细胞群体。然而,手动测量汇流的方法是主观的,而大多数自动化方法需要荧光染色或染料。在这里,我们描述了一种使用高对比度亮场图像和Gen5图像分析来测量汇流的自动无标签技术。这种可靠而方便的方法能够准确量化细胞增殖随时间的变化,并在多个实验和时间点上对数据进行规范化。
动态增殖细胞处理
随时间的汇流值是由在动力学增殖实验期间收集的高对比度亮场图像确定的。在播种微板时,初始细胞密度应考虑到细胞倍增时间和实验持续时间。为期四天的实验,在96孔的微孔板中每孔播种2000个细胞,这是一个很好的开始,细胞系的倍增时间约为24小时。在开始检测前,允许细胞有足够的时间粘附在微孔板上。
Gen5™工作流程概述
第5代成像程序
使用配备高对比度亮场的Cytation™或Lionheart™FX获取图像。
- 选择4x PL FL (4x PLN)物镜。
- 通道1选择“亮场”。
- 点击频道1查看镜像设置。
- 点击使细胞对焦并确定曝光设置。
注意:单元格应该出现在焦点中,并且比背景暗(图1)。Gen5中的自动对焦和自动曝光设置对于大多数单元格类型的高对比度亮场图像都很有效,尽管一些应用程序可能会受益于调整这些设置。 - 点击
- 如果使用激光自动对焦,捕获参考扫描。
Gen5细胞分析设置
Gen5细胞分析功能能够从高对比度亮场图像中准确识别细胞轮廓。以下设置已在HT-1080、NIH3T3、HeLa和HCT116上验证,并推荐用于分析其他细胞类型的起始值(表1)。合流测量不需要对高对比度亮场图像进行预处理。
- 打开数据简化窗口并添加一个新的细胞分析的一步。
- 集主要的面具在单元格周围使用来自的值表1.
- 在计算指标选项卡,点击若要删除默认井位结果,请单击选择或创建感兴趣的对象级指标…
- 在管理对象级度量,点击
- 创建融合指标(图2)。
图2。自定义对象度量窗口,用于创建汇流度量。合流的计算方法是:总(Sum)掩蔽面积(area)除以总图像面积(2874661 mm2),再乘以100得到yield %。
测试汇流协议
通过在选定的几口井上运行该协议,测试图像采集和分析设置。现在可以在平板矩阵数据字段中查看汇流百分比,也可以在平板窗口(图3A)和分析工具(图3B)中显示单个井的汇流百分比。确认所有单元周围的掩模已准确放置。
图3。显示在(A)板块窗口和(B)分析工具中显示的汇流百分比度量的屏幕截图。
调整汇流协议设置
如果需要修改元胞分析设置,则调整阈值应足以处理大多数条件变化。较小的单元格类型可能需要减小最小对象大小,但是对该设置的调整应考虑到将碎片包含到分析中的可能性。所有的设置都应该通过视觉确认细胞周围轮廓的准确放置来经验地确定(图4)。一旦您对细胞分析设置感到满意,该协议现在就可以为端点应用或动力学增殖实验测量合流了,并且应该保存以供将来使用相同或类似的细胞类型。
图4。视觉确认单元格轮廓的放置。阈值设置过高将导致细胞被排除在分析之外。相反,阈值过低将在分析中包含背景。最佳设置将导致轮廓准确放置在所有单元格周围,同时排除背景。