双波长测量补偿光干扰

使用BioTek ELx808IU Microplate Absorbance Reader进行板盖和诱导冷凝实验

双波长用于许多基于微板的应用，以减少由划痕、指纹或其他物质引起的光干扰，这些物质在两个波长上都吸收光。例如，许多研究人员更喜欢在有盖子或膜密封的地方读取基于微板的分析，以减少生物危害和蒸发。由于使用了盖子，在检测过程中可能会有冷凝物聚集在盖子上。为了说明双波长在这些类型的应用中的好处，BioTek进行了实验，展示了在单波长和双波长下读取时，有或没有冷凝的板盖对结果的影响。实验表明，当读取板在两个波长和光密度的差异计算，该技术充分补偿了这些影响。

实验结果

该实验使用BioTek对单波长和双波长测量技术进行了比较ELx808IU吸光度微孔板阅读器和一个充满的微孔板，有和没有盖子和冷凝存在。使用NUNC MaxiSorp 12-1x8可拆卸条形微孔板。测试了两种不同的板盖:NUNC 96孔硬盖和市场上许多检测试剂盒中常见的通用胶粘剂盖。用8通道微量移液器将200μl去离子水注入A1-A12孔，将QC染料2号和QC染料3号(分别为P/Ns 7120783和7120784,BioTek Instruments, Winooski, VT) 3:5稀释后注入其余孔。然后在单波长和双波长下读取板。将板盖应用到板上，并在单波长和双波长下再次读取。随后在5℃下孵育30分钟以诱导冷凝，然后在单波长和双波长下重新测量板盖上可见冷凝。表1显示了实验过程的图表，包括每个读数的平均板光密度(OD)和平均板CV%。

胶粘软板盖板

板,读	波长	盖子现在	可见冷凝	平均板外径	平均平板CV%
P1, R1	单(450)	没有	没有	1.107	0.646
P1, R2	双(450630)	没有	没有	1.07	0.501
P1, R3	单(450)	是的	没有	1.229	0.721
P1, R4	双(450630)	是的	没有	1.085	0.604
制冷
P1, R5	单(450)	是的	是的	1.566	0.670
P1, R6	双(450630)	是的	是的	1.086	0.730

NUNC硬板盖板

板,读	波长	盖子现在	可见冷凝	平均板外径	平均平板CV%
P2, R1	单(450)	没有	没有	1.109	0.726
P2, R2	双(450630)	没有	没有	1.071	0.734
P2, R3	单(450)	是的	没有	1.15	0.669
P2, R4	双(450630)	是的	没有	1.069	0.725
制冷
P2, R5	单(450)	是的	是的	1.37	1.640
P2, R6	双(450630)	是的	是的	1.064	0.697

表1。平板读数与平均平板ODs和平均平板CV%的比较单波长和双波长技术。

单波长胶粘剂板盖的存在使平均外径增加10%以上(P1,R1 vs. P1,R3)。然而，在双波长下，有胶粘剂板盖和没有胶粘剂板盖的平均外径差异仅为1.5% (P1,R2 vs. P1,R4)。在5°C孵育用于诱导冷凝后，结果更加明显。在单波长下，由于板盖上存在冷凝，平均外径增加了近25% (P1,R3 vs. P1,R5)，而双波长平均外径补偿了不到0.5%的增加(P1,R4 vs. P1,R6)。

NUNC封面的结果类似，但不太明显。使用单波长测量时，平均OD值增加了3.7% (P2,R1 vs. P2,R3)，而使用双波长时，差异几乎无法检测到0.02% (P2,R2 vs. P2,R4)。在5℃孵育后，双波长补偿明显产生差异。在单波长下，由于板盖上存在冷凝，平均外径增加了近20% (P2,R3 vs. P2,R5)，而双波长平均外径补偿增加不到0.046% (P2,R4 vs. P2,R6)。NUNC覆盖的CV%的变化也说明了双波长的补偿特性。在单波长下，有凝聚和无凝聚时CV%的变化均超过100% (P2R3 + P2R5)，而在双波长下(P2R4 + P2R6)， CV%的变化仅为4%左右。

结论

当移液时板和流体之间存在温差时，或者当填充板经历明显的温度变化时，板盖上的冷凝可能是显著的。如果冷凝在板盖上形成，光散射效应可以显著改变吸光度读数和cv。通过利用两个波长的读数和从读数波长的吸光度减去参考波长的吸光度来补偿凝结的这些有害影响。

强烈建议任何研究人员在板盖到位的情况下进行分析读数，获得一个允许在宽光谱上进行双波长读数的微孔板阅读器，并在物理上容纳覆盖板。BioTek符合这些标准ELx808IU而且ELx800UV吸光度微孔板阅读器，其波长范围分别为340 ~ 900nm和340 ~ 750nm，同时还可以在阅读室中容纳各种板盖。