DNA定量使用Gen5™

作者 : Peter J. Brescia和Peter Banks，应用部门，BioTek Instruments, Inc.， Winooski, VT

本技术说明描述了使用BioTek微板读取器和Gen5™软件进行dsDNA定量的方法。该方法适用于BioCell™、微板或Take3™微体积板。本文概述了所做的计算、计算的细节以及对第5代操作的讨论。

简介

来自各种来源的核酸的定量，特别是dsDNA，通常是用紫外分光光度法完成的。传统的测量是在基于比色皿的分光光度计中完成的，该分光光度计的通径长度为1cm，符合比尔-朗伯定律:

A = εlc，其中A为测量的吸光度，ε为分析物的消光系数，l为测量的路径长度，c为吸收种的浓度。

对于dsDNA的定量，平均质量消光系数ε_dsDNA通常是使用。ε_dsDNA等于0.020 (μg/mL)^－1厘米^－1，其中光密度(OD)的测量等于1吸光度单位(A₂₆₀或OD = 1)在1 cm路径长度的血管中，结果如下:

为简单起见，通常使用50 μg /mL/OD与1 cm路径长度的导管，通过将测得的吸光度乘以50来计算DNA浓度:

DNA定量也可以在微孔板读取器中执行，处理比比试管分光光度计更多的样品。基于微板的分析的主要挑战是，微板中测量的路径长度不是由容器固定的，而是由井中溶液的体积固定的，它可以变化。有一些方法可以将测量归一化到1厘米的路径长度，我们将在后面讨论。已经开发了各种附件，为microplate阅读器提供固定的路径长度，如那些提供1厘米路径长度的(BioCell或塞子试管)，以及那些允许微体积分析(Take3 Plate) -见图1。特别是微体积分析是一种非常有用的DNA定量方法，因为其路径长度短，不需要对样品进行任何稀释。

图1．微版阅读器的多卷分析功能。

在本技术说明中，我们将描述用于精确定量dsDNA的典型计算和修正。我们将演示这些适用于生物细胞(试管)中1厘米路径长度测量，微孔板中可变路径长度测量和使用Take3或Take3 Trio板的微体积测量。为了清楚起见，我们将首先简要概述所做的计算，然后在单独的部分中详细计算。

概述

BioCell(或试管)

测量通常在波长260、280和320 nm进行。一个₂₆₀是核酸定量的首选波长。一个₂₈₀检测为核酸纯度的评估提供了一种手段，通常对新鲜分离的样品进行检测，作为一种质量控制措施。最后,一个₃₂₀测量的目的是为了纠正与悬浮液中可能源于分离过程的不溶性微粒有关的光散射。除了在样品上进行这些测量外，还在空白上进行同样的三次测量，空白的体积和溶剂与样品相同。

因此，使用BioCell进行精确定量的步骤如下:

1. 在空白上获得所有三个波长的原始光密度测量
2. 获取样品上所有三个波长的原始光密度测量
3. 减去一个₃₂₀样品和空白的测量
4. 执行空白减法
5. 用校正后的A的比值来评估核酸纯度₂₆₀/一个₂₈₀: 1.8 - 2.0的比值表示核酸纯度高
6. 通过乘以校正后的A计算样品的浓度₂₆₀测量了50

微型板块

微板通常用于处理多个样品。许多微板制造商提供紫外线透明板，理想的核酸定量。由于板材制造过程中产生的缺陷可能会影响结果，因此应对微孔板的每孔进行空白减法。为了简单起见，这些空白测量是用一个空的盘子，然后再进行取样。回想一下，微孔板测量中的路径长度是由井中所含溶液的体积决定的。使用Gen5软件的微板分析利用了水在977 nm处的一个小但可测量的峰值吸光度。在900纳米的测量用于背景校正。样品测量值与1 cm处标准吸水率的比值用于确定每口井的路径长度。

这被认为是一个常数，Gen5使用值0.18来表示1厘米路径长度的情况。因此，路径长度可按下式计算:

然后，通过将样本测量值除以计算的路径长度，就可以对其进行路径长度校正。这基本上将数据规范化为1厘米的路径长度。

因此，使用微板和Gen5软件进行精确定量的步骤如下:

1. 在A处获得空白测量值₂₆₀和一个₂₈₀使用空的微板
2. 在A处获得样品的原始光密度测量值₂₆₀,一个₂₈₀,一个₉₀₀和一个₉₇₇
3. 计算每个样本井的路径长度(由Gen5自动完成)
4. 执行空白减法
5. 用校正后的A的比值来评估核酸纯度₂₆₀/一个₂₈₀: 1.8 - 2.0的比值表示核酸纯度高
6. 计算路径长度修正结果(由Gen5自动完成)
7. 通过乘以校正后的A计算样品的浓度₂₆₀测量了50

Take3 Micro-Volume板

Take3附件的公称路径长度为0.5 mm，由两个石英滑片定义(见图1)。在制造过程中，精确的路径长度进行校准，并导入到Gen5软件中。如果需要使用用户手册中描述的过程，可以通过Gen5软件进行重新校准。下料有两种选择。推荐的方法是使用每个微孔进行下料，首先测量毛坯，清洗微孔，然后添加样品和重新测量。这被称为井间冲裁。第二种方法是使用一些微孔进行落料，其余的用于取样。这种方法称为空白平均法。这种方法具有快速分析的优点(不需要有单独的空白和样品负载)，但可能导致比井间落料的读数精度略低。报告光密度读数也有两个选项:要么归一化到0.5毫米路径长度;或至1厘米路径长度。

Gen5自动读取步骤和使用Take3板进行精确量化所需的计算。

井间消隐:

1. 在A处获得原始光密度测量值₂₆0,₂₈₀和一个₃₂₀在空白
2. 在A处获得原始光密度测量值₂₆₀,一个₂₈₀和一个₃₂₀在示例
3. 减去一个₃₂₀样品和空白的测量
4. 执行空白减法
5. 用校正后的A的比值来评估核酸纯度₂₆₀/一个₂₈₀: 1.8 - 2.0比值表示核酸纯度高
6. 纠正一个正常化₂₆₀至0.05或1cm路径长度(可选)
7. 通过乘以校正后的A计算样品的浓度₂₆₀测量分别用20 * 50或50进行0.05或1 cm径长归一化测量。

空白的平均:

1. 在A处获得原始光密度测量值₂₆₀,一个₂₈₀和一个₃₂₀样品微井和空白微井
2. 减去一个₃₂₀样品和空白的测量
3. 执行空白减法
4. 用校正后的A260/A280比值评估核酸纯度:比值为1.8 - 2.0表示核酸纯度高
5. 纠正一个正常化₂₆₀至0.05或1cm路径长度(可选)
6. 通过乘以校正后的A计算样品的浓度₂₆₀测量分别用20 * 50或50进行0.05或1 cm径长归一化测量。

计算

注意:

许多计算由Gen5自动执行，包括空白减法和路径长度校正(用于微板测量)。

BioCell:标准的1厘米路径长度

为每个样品井收集原始数据

(步骤一及二):

计算每个样本井的双色结果(步骤3)

计算每个样本井的空白校正结果(步骤4)

计算每个样本井的比率(步骤5)

该比率是基于缓冲区校正结果。

计算每个样品孔的浓度(步骤6)

微板:可变路径长度

当使用路径长度校正的微板进行测定时，需要进行以下计算。

收集每个样本井的原始数据(步骤1和2)

计算每个样本井的路径长度(步骤3)

Gen5使用默认值0.18作为1厘米处水的吸光度。

计算每个样本井的空白校正结果(步骤4)

计算比率(步骤5)

计算路径长度修正结果(1cm)(步骤6)

浓度

取三:公称0.5 mm径长，井间冲裁

当使用Take3微体积测量法进行井间冲裁时，使用Gen5进行以下计算。

收集每个样本井的原始数据(步骤1和2)

计算每个样本井的双色结果(步骤3)

计算每个样本井的空白校正结果(步骤4)

计算每个样本井的比率(步骤5)

(可选)计算路径长度校正结果(0.5 mm)每个样本井(步骤6选项)。
如果首选项是将结果规范化到0.5 mm，则执行此步骤(参见下面的首选项)。

(可选)计算路径长度(每个样本井的校正结果(1 cm)(步骤6选项)
如果首选项是将结果规范化为1 cm(参见下面的首选项)，则执行此步骤。

计算每个样品孔的浓度(步骤7)

Take3:公称0.5 mm路径长度，空白平均

当使用空白平均值进行Take3微体积测量时，Gen5执行以下计算。

收集所有空白的原始数据(空白的第一步)

收集每个样品井的原始样品数据(样品的第一步)

计算所有空白井的双色结果(空白井的步骤2)

计算每个样本井的双色结果(样本的步骤2)

计算空白井的平均双色结果(步骤3)

计算空白校正结果(步骤3)

计算比率(步骤4)

(可选)路径长度(0.5 mm)(步骤5选项)
如果首选项是将结果规范化到0.5 mm，则执行此步骤(参见下面的首选项)。

(可选)路径长度(1cm)(步骤5选项)
如果首选项是将结果规范化为1 cm(参见下面的首选项)，则执行此步骤。

浓度

Gen5使用Take3 Plate测量步骤

通过任务管理器窗口中Take3应用程序下的核酸定量选择，通过Gen5界面，使用BioCell、试管或带Take3板和Gen5软件的微体积分析来完成核酸样品的测量(图2)。

图2:在试管，生物细胞或Gen5中的微型体积中定量dsDNA，首先从Read Now菜单中选择Take3应用:核酸定量。

Take3用户界面窗口允许选择的样本类型(步骤1)和井型(步骤2)从下拉菜单(图3)。一旦选择好类型是由适当的阅读位置将突出显示在板位置地图(试管读Take3板的位置浅蓝色突出显示)(图3)。默认的样本类型设置可以查看和修改样本类型可以通过选择核酸样本类型从Take3菜单(步骤3)，选择dsDNA并点击查看/修改按钮(步骤4)(图3)。dsDNA分析的默认读取参数包括如上所述的双色测量以及在参考波长320 nm下的测量。还可以选择一个次级比波长来获得关于样品纯度的额外信息，通常为230 nm。

图3:样品类型:dsDNA(1)和孔类型:Cuvette或BioCell™(2)1厘米路径长度测量。在Take3菜单(3)中选择核酸样本类型，选择dsDNA，点击查看/修改按钮(4)显示样本类型参数。

测量数据以Excel格式导出，根据选择的容器类型略有不同。测量分两个步骤读取，两个读取步骤中的第一个步骤在读取样品之前提供适当溶剂的冲裁数据(图4)。冲裁数据导出到Excel，一旦批准了满意的冲裁值，就可以进行样品测量(图5)。

图4:在进行样品测量之前，需要进行下料步骤。

图5:一旦读取了合适的冲裁方案，必须通过在读取样品测量之前点击Approve按钮来验证冲裁数据的批准。

图6是在比色皿中测量样品时导出的数据。第9-12行中的数据表示使用第25行中的数据减去的空白数据，并在采样测量后导出到Excel。的一个₂₆₀/一个₂₈₀比率是用空白减去的值除以:

而浓度则代表空白的A₂₆₀值乘以dsDNA的修正因子:

图6:样本读取后，数据被导出到Excel作为一个新的工作表。

可以使用批准的空白数据进行多次连续的样本读取。一旦完成了所有读取操作，单击Gen5™软件界面中的End of Batch按钮就会生成摘要(图7)。

图7:选择End of Batch将结束读会话并导出会话期间发生的所有空白读和样例读的摘要。

批处理结果既包含原始测量数据，也包含空白，路径长度校正数据归一化到用户选择的偏好(0.5 mm或1 cm)，以及浓度决定因素(图8)。

图8:用比色皿进行dsDNA测量的样本数据。

Gen5™微板测量步骤

使用标准的Gen5协议设置和读取步骤进行Microplate测量，如图9所示。第一个读步骤是预读，以收集上面讨论的空白减法的数据。然后，板被弹出板加载样品，随后在260和280 nm的吸光度测量。

注意:在第二个读步骤中选择路径长度校正，以计算如上所述的可变路径长度(图10)。

图9:在对dsDNA样品进行微板分析时，首先对板进行预读，然后用标准Gen5协议在260和280 nm处加载样品和测量。

图10:在样品测量过程中，选择路径长度校正以确定微微板测量固有的可变路径长度。

数据缩减步骤包括260 nm和280 nm测量的预读数据的空白减法，如图11中260 nm测量的详细情况所示。

图11:代表对话框中Gen5软件的数据约简为delta变换的空白减法的A₂₆₀测量。

的一个₂₆₀/一个₂₈₀然后可以使用图12所示的转换为每个样本确定比率，因为它与路径长度无关。

图12:代表对话框在Gen5软件中进行数据约简的比例变换，以确定A₂₆₀/一个₂₈₀样品纯度评估比率。

修正后的路径长度₂₆₀然后通过确定空白A₂₆₀数据到由Gen5™软件确定的路径长度(图13)。

图13:用空白260数据除以Gen5软件路径长度校正函数确定的路径长度的比值，将数据归一化为1厘米的路径长度测量。

路径长度修正A₂₆₀然后将值与dsDNA的校正因子一起用于最后的数据还原转换步骤，以确定样品浓度(图14)。

图14:修正后的路径长度₂₆₀测量值乘以50 μg/mL/OD的校正因子得到样品浓度。