使用自动细胞成像测定细胞汇合度，以验证在严格的细胞洗涤过程中细胞的保留

摘要

在这里，我们展示了使用自动细胞成像和自动细胞融合分析来验证严格的细胞洗涤后的细胞保留。三种不同细胞系在三个洗涤周期内细胞损失最小。

简介

随着基于细胞的检测在更高密度的微板格式中不断被采用，自动化工作流程越来越受欢迎。当诸如培养基交换和细胞洗涤等过程与试剂添加结合起来实现自动化时，提高样品吞吐量和检测重现性是最好的。与手动方法相比，这些自动化工作流可以设计为提供直接解决方案，提高性能。

许多基于细胞的分析方法依赖于跨越光谱的荧光报告蛋白和染料的组合，在单个微板孔上实现多参数分析(图1)。任何基于细胞的分析方法的首要任务是优化细胞种子密度，而整个工作流程中的细胞保留是确保最佳分析性能的关键因素。这变得更加重要，因为工作流程变得越来越复杂，例如实验程序，需要许多液体处理步骤，包括一个或多个细胞清洗和试剂分配步骤。当进行活细胞检测时，当分析依赖于几个不同时间点的数据时，细胞保留的重要性就变得更加复杂。在这里，我们描述了自动图像捕获、处理和分析的使用，将其作为量化微微板中细胞保留的方法，并帮助优化自动液体处理参数和分析过程中的数据规范化。

图1所示。4倍放大下，MCF7细胞组成表达GFP(绿色)，细胞核染色(蓝色)。

材料与方法

材料

MCF7、HeLa和NIH3T3细胞在来自Life Technologies (Waltham, MA, USA)的高级DMEM (cat # 12491)中培养，并添加10%胎牛血清，2mM谷氨酰胺。黑色边，透明底部96孔(猫号3904)来自康宁。

仪表

液体处理

所有的自动细胞清洗都是使用EL406™组合洗衣机分配器。EL406提供完整的板清洗连同三个试剂分配器在一个，紧凑的仪器。采用蠕动泵和注射泵分配器。为了保持无菌，将EL406清洗机放置在生物安全柜中，蠕动泵的5 μL盒在使用前用高压灭菌法灭菌。

细胞培养和微板播种

MCF7、HeLa和NIH3T3细胞在添加10%胎牛血清和青霉素-链霉素的高级DMEM中培养，37℃，5% CO2。培养物在80%汇合时常规胰酶化(0.05%胰蛋白酶- edta)。在实验中，细胞被镀到康宁P/N3904黑边透明底部96孔微板中，使用EL406的泵外分配器，每孔5000个细胞。制备好的平板在室温下保存，并在成像前避光。

成像

细胞成像使用a2022世界杯南美区预选赛 细胞成像多模式阅读器(BioTek Instruments, Inc.， Winooski, VT)配置了一个GFP光立方。该显微镜使用LED光源结合带通滤波器来提供适当波长的光。GFP光立方使用470/22 nm激励滤波器和510/42 nm发射滤波器。安装的物镜包括4倍和10倍放大。

Gen5分析

自动图像捕获，处理和分析使用Gen5™Microplate Reader and Imager Software (BioTek Instruments, Inc.， Winooski, VT)。在每个细胞洗涤步骤之前和之后，使用蓝色和绿色通道捕获图像。

在执行分析方法之前，对所有收集的图像进行预处理以使背景平坦。使用绿色通道进行图像统计，以测量构成表达的细胞GFP，以确定细胞融合。默认参数产生了足够的计算数据供进一步分析。

结果

对表达GFP的几个细胞系的自动图像捕获用于评估细胞单层的完整性，以优化与传统工作流程使用的细胞洗涤参数。使用优化的洗涤参数对96孔微孔板的12个代表性井进行了几轮自动细胞洗涤前后的成像(图2)。通过对井中单个4倍放大图像的可视化，可以确定微孔板井中细胞保留的估计。然而，自动化图像分析为工作流过程的验证提供了快速、定量的细胞汇合度测定。通过分析GFP信号强度(绿色通道)来确定汇合率(图2a和b)。

图2。自动清洗前和后的电池汇流分析。表达GFP的MCF7细胞被植入96孔的微孔板中进行自动细胞洗涤。在12个有代表性的孔中，使用4倍物镜对细胞进行3次自动细胞洗涤前后的成像，并应用初级掩膜来确定细胞汇合度。表达GFP的MCF7细胞的图像(A)洗前，(B)洗后。

细胞融合提供了一种方法，通过识别像素强度高于代表感兴趣对象的定义阈值来确定细胞密度(图3a)。然后通过将满足条件的所有像素除以图像总像素乘以100来计算Confluence(图3b)。

图3。细胞融合分析。通过在Gen5软件中识别所有满足定义标准的像素来执行单元汇流。在这种情况下，绿色通道用于:(a)基于像素信号强度识别小区密度;(b)百分比(%)单元汇合度通过确定超过定义阈值(绿色通道)的像素，除以图像中的总像素乘以100来计算。

整个孔也可以成像为蒙太奇和缝合，以确定细胞保留在整个微孔板。Gen5软件中蒙太奇成像的默认设置使图像对齐，以便有足够的重叠来适当拼接图像瓷砖，以提供增加的视野。这确保了准确的下游分析，如细胞计数或汇流测量的评估。

图4显示了强烈洗涤后表达gfp的MCF-7细胞。该图像是由一个5x4蒙太奇已经缝合在一起提供了一个视野，包括一个96孔微板的整个井。从图像中可以明显看出，细胞保持良好。

图4。全井成像。使用4x物镜拍摄5x4蒙太奇图像，并使用Gen5进行缝合，以便观察整个井面进行分析。如图所示为缝合图像的一段特写(右图)。

结论

使用自动化过程来改进工作流可以极大地减少可变性和劳动。在基于细胞的分析中使用更高密度的微板可以进一步提高通量，并有助于降低与试剂使用相关的成本。优化自动化流程，如常规培养基交换，细胞清洗和试剂添加，有助于提高检测的重复性。通过适当的仪器设置来减少细胞损失，但仍然提供有效的洗涤，可以保持检测性能。